Survivin对肿瘤细胞自噬溶酶体形成过程相关基因表达调控的研究

摘要

目的：研究Survivin对肿瘤细胞自噬溶酶体形成过程相关基因的表达调控。
　　方法：在实验室建立自噬诱导模型，使用IKKβ的抑制剂TPCA-1以及Survivin的过表达载体质粒对自噬模型进行干预。通过透射电镜，激光共聚焦显微镜观察自噬体和自噬进展状态，qPCR和Western blot等分子生物学方法对自噬溶酶体形成阶段相关基因的表达变化进行检测，使用流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况。
　　结果：通过雷帕霉素诱导ECA109细胞和KYSE450细胞后，透射电镜下可见更多的自噬体，激光共聚焦显微镜下可见细胞表达LC3增加，Western blot检测显示RAPA诱导后，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达量有逐渐升高的趋势；激光共聚焦显微镜采图并对相应结果计数，过表达Survivin后KYSE450细胞自噬模型中显示红色荧光的细胞数目降低（P<0.05），含有红色荧光颗粒的细胞数目降低（P<0.05）；加入TPCA-1干预后，ECA109细胞自噬模型中红色、绿色荧光颗粒数和含有红色荧光颗粒的细胞数目减少（P<0.05），KYSE450细胞自噬模型中显示红色荧光的细胞数目、含有红色荧光颗粒的细胞数目均减少（P<0.05）；qPCR检测自噬溶酶体形成过程相关基因发现，Survivin过表达载体质粒转染后，可以在基因转录和蛋白水平检测到Survivin表达量升高（P<0.05）；过表达Survivin时，Rab7、TAK1、LAMP1 mRNA表达量减少（P<0.05）；TPCA-1干预后，在ECA109细胞中Rab7 mRNA的表达量升高（P<0.05），LAMP1 mRNA的表达量降低(P<0.05)；在KYSE450细胞中IKKβmRNA的表达量降低（P<0.05），Rab7mRNA的表达量降低(P<0.05)，TAK1 mRNA的表达量降低(P<0.05)；在蛋白水平，过表达Survivin时自噬体形成过程相关蛋白的表达没有显著变化；流式细胞仪检测凋亡，显示TPCA-1干预后，ECA109细胞48h的凋亡增加。
　　结论：雷帕霉素诱导可成功建立自噬模型；Survivin和TPCA-1对细胞自噬有抑制作用；在自噬溶酶体形成过程中， Survivin的过表达在基因转录水平可能对Rab7、TAK1、LAMP1 mRNA的表达有抑制作用；TPCA-1可促进ECA109细胞自噬模型的48h凋亡。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

内容与方法

1.1实验材料

1.2 试剂设备

2.1 技术路线图

2.2 建立自噬模型

2.3 图片采集及观察

2.4 qPCR

2.5 Western blot

2.6 细胞凋亡

3 质量控制

4 统计学方法

结果

1 图片结果

1.1 自噬模型电镜鉴定

1.2 激光共聚焦

1.3 Western blot

2 qPCR

3 Western blot

4 细胞凋亡

讨论

小结

致谢

参考文献

综述:自噬分子调控机制的研究进展

攻读学位期间发表的学术论文

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