甘松干预AngⅡ损伤心脏微血管内皮细胞、2K1C高血压心脏损害机制研究及基于NMR代谢组学分析

摘要

目的：
　　第一部分：构建大鼠心脏微血管内皮细胞（CMVECs）原代培养、鉴定平台；通过对细胞活力、凋亡率、凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase-3表达及细胞NO、LDH、SOD、GSH-Px、MDA的研究，探讨甘松醇提取物（NCBEE）和水提取物（NCBAE）对AngⅡ所致CMVECs损伤的影响。
　　第二部分：建立2K1C肾血管性高血压大鼠模型；通过对各组大鼠SBP、心脏超声、凋亡相关蛋白表达及血清指标等的检测和分析，研究NCBEE、NCBAE对2K1C高血压大鼠心脏损害的影响。
　　第三部分：采用代谢组学技术研究NCBEE和NCBAE干预后各组大鼠血清代谢物的变化，探讨药物对2K1C高血压大鼠可能的作用机制。
　　方法：
　　第一部分：（1）选用雄性Wistar大鼠，用剪切、酶消化法从大鼠左心室肌组织分离和培养CMVECs，并对细胞进行Ⅷ因子、vWF相关抗原荧光免疫染色鉴定。（2）MTT法检测AngⅡ对CMVECs活力的影响；采用流式仪检测AngⅡ不同干预时间对细胞凋亡率的影响；Western blot法检测各组细胞 Bcl-2、caspase-3蛋白表达情况。（3）实验分为Con、AngⅡ、AngⅡ+Ator、Ang II+NCBEE（H）、Ang Ⅱ+NCBEE（M）、AngⅡ+NCBEE（L）、AngⅡ+NCBAE（H）、AngⅡ+NCBAE（M）和AngⅡ+NCBAE（L）组；采用MTT法检测NCBEE、NCBAE对受损CMVECs活力的影响；TUNEL法检测各组细胞凋亡率的变化；Western blot法检测各组细胞Bcl-2、caspase-3蛋白表达情况；检测和分析药物对细胞上清液NO含量、LDH、GSH-Px活力、MDA含量，及细胞SOD活力的影响。
　　第二部分：选用血压正常的健康雄性Wistar大鼠108只，随机分为Sham组（n=12）和模型组（n=96）。采用“U”型银夹对模型组大鼠造成左侧肾动脉狭窄，建立2K1C高血压大鼠模型，Sham组仅游离左肾动脉，不予狭窄。将复制成功的96只2K1C高血压大鼠，随机分为2K1C、2K1C+Ator、2K1C+NCBEE（H）、2K1C+NCBEE（M）、2K1C+NCBEE（L）、2K1C+NCBAE（H）、2K1C+NCBAE（M）和2K1C+NCBAE（L）组。术后第7w开始连续给药6w。每周测1次尾动脉SBP，观察各组大鼠SBP的变化；采用超声心动图检查，观察药物对2K1C高血压大鼠左室结构及功能的影响；分析NCBEE、NCBAE对模型大鼠左室质量指数的影响；采用HE染色法，镜下观察各组大鼠心肌细胞形态学改变，及细胞CSA变化；Western blot法检测各组大鼠左心室组织Bcl-2、Caspase-3表达情况；并检测和分析各组血清NO含量、LDH、SOD、GSH-Px活力及MDA含量变化。
　　第三部分：2K1C肾血管性高血压大鼠模型的建立及实验分组同第二部分。连续给药6周后取各组大鼠血清，采用核磁共振波谱仪测定血清标本的1H-NMR谱，对所有的图谱行傅立叶变换后进行基线和相位的调整，分段自动积分。用SIMCA-P+11软件采用正交偏最小二乘判别分析法进行分析，寻找各组血清中的差异性代谢成分，并作出相关代谢途径的可能解释。
　　结果：
　　第一部分：（1）采用机械剪切、酶消化及过滤的方法，可成功获得大鼠CMVECs，镜下细胞形成单层后呈典型的“鹅卵石”样排列。（2）CMVECs经0.01、0.1、1和10μmol·L-1浓度AngⅡ干预后，细胞形态细长或皱缩变形，排列无规律性，细胞活力呈浓度依赖性下降，随AngⅡ药物浓度的增高而减弱（P＜0.05；余均P＜0.01），当1μmol·L-1 AngⅡ干预时间超过20h后，除可导致损伤性细胞形态改变外，形成管腔样结构的能力明显减弱；凋亡检测结果发现，细胞凋亡率随AngⅡ干预时间（4h、8h至24h）的延长而逐渐增高（P＜0.05；余均P＜0.01）；Western blot结果显示， AngⅡ干预（8h、12h至20h）后Bcl-2表达降低（均P＜0.01），cleaved caspase-3表达上调（均P＜0.01），呈时间依赖性，提示AngⅡ能够通过上调cleaved caspase-3、下调Bcl-2蛋白表达诱导细胞凋亡。（3）与Con组比较，AngⅡ组细胞形态细长、皱缩变形，细胞数量减少，细胞活力降低（P＜0.01）；与AngⅡ组相比，高、中、低浓度NCBEE、高浓度NCBAE预处理后，细胞形态结构得到一定的保护，细胞活力得到改善（均P＜0.01）。凋亡检测结果显示，AngⅡ组凋亡率较Con组增高（25.55±3.23％ vs2.26±0.89%，P＜0.01）；与AngⅡ组比较，AngⅡ+NCBEE（H）（P＜0.01）、AngⅡ+NCBEE（M）（P＜0.01）、AngⅡ+NCBEE（L）（P＜0.01）及AngⅡ+NCBAE（H）（P＜0.01）、AngⅡ+NCBAE（M）组（P＜0.01）凋亡率降低。Western blot结果发现， AngⅡ损伤组CMVECs Bcl-2蛋白表达水平较Con组下降（0.22±0.03 vs0.71±0.09，P＜0.01），cleaved caspase-3表达上调（0.55±0.06 vs0.20±0.02，P＜0.01）；与AngⅡ组比较，Ang II+NCBEE（H）、（M）及AngⅡ+NCBAE（H）、（M）组Bcl-2蛋白表达上调，cleaved caspase-3表达下降（均P＜0.01），提示两种NCB提取物可能通过调节Bcl-2、caspase-3表达，抑制凋亡而发挥细胞保护效应。此外，与Con组比较，AngⅡ组NO含量（30.67±2.42μmol/L vs59.03±8.99μmol/L，P＜0.01）、SOD活力（113.89±9.34 U/mgprot vs165.05±23.05 U/mgprot，P＜0.01）、GSH-Px活力（21.49±2.56 U/ml vs55.42±5.95 U/ml，P＜0.01）降低，LDH活力（864.61±45.94 U/L vs456.01±46.89 U/L，P＜0.01）、MDA浓度（2.41±0.29nmol/ml vs1.42±0.24nmol/ml， P＜0.01）增高；但经NCBEE、NCBAE预处理后，NO含量（P＜0.01）、SOD活力（P＜0.05）、GSH-Px活力（P＜0.01）增高，LDH活力（P＜0.05）、MDA浓度（P＜0.01）降低，减轻细胞损伤，改善细胞功能。
　　第二部分：在体研究中，与Sham组比较，术后6w2K1C组大鼠SBP增高较明显；经药物干预后，与2K1C组比较，NCBEE（H）、（M）、和NCBAE（H）、（M）组SBP降低，提示该药物具有一定的降压效应。心脏超声结果显示，与Sham组相比，模型组大鼠LVPWd（1.72±0.28mm vs1.55±0.24mm，P＜0.05）、LVPWs（2.78±0.16mm vs2.52±0.31mm，P＜0.01）、IVSd（1.89±0.28mm vs1.44±0.23mm，P＜0.01）、IVSs（2.92±0.29mm vs2.51±0.31mm，P＜0.01）增大，LVDd（5.83±0.39mm vs6.62±0.52mm，P＜0.01）、LVEF（59.71±7.65%vs70.20±5.05%，P＜0.01）和LVFS（33.89±6.81%vs39.17±3.73%，P＜0.05）减低；药物干预6 w后，2K1C+NCBEE（H）、2K1C+NCBAE（H）组LVPWd（均P＜0.05）、LVPWs（P＜0.05；P＜0.01）、IVSd（均P＜0.01）和IVSs（均P＜0.05）均较2K1C组减小，LVEF（均P＜0.01）增高，提示NCBEE、NCBAE对高血压大鼠左室重构有一定的改善作用。此外，2K1C组大鼠LVW、LVW/BW较Sham组增高（均P＜0.01），心肌细胞CSA增大（P＜0.01）；而经NCBEE（H）、NCBAE（H）干预后，LVW、LVW/BW减低，细胞CSA减小，心肌细胞形态结构得到一定的改善。心室组织凋亡相关蛋白检测结果显示，2K1C组较Sham组Bcl-2表达下降（0.21±0.03 vs0.65±0.07，P＜0.01）， Cleaved caspase-3表达上调（0.58±0.04 vs0.19±0.02，P＜0.01）；该变化经由高、中剂量NCBEE和NCBAE干预后得到改善，使Bcl-2表达上调， cleaved caspase-3表达下降（均P＜0.01）。血清指标检测结果示，2K1C组较Sham组血清NO浓度（36.56±5.32μmol/L vs83.43±5.08μmol/L，P＜0.01）、SOD（24.38±4.15 U/ml vs43.92±3.26 U/ml，P＜0.01）、GSH-Px（57.92±4.18 U/ml vs139.23±15.74 U/ml，P＜0.01）活力降低，LDH活力（944.09±44.10 U/L vs582.45±19.97 U/L，P＜0.01）、MDA浓度（13.56±1.39nmol/ml vs5.51±0.75nmol/ml，P＜0.01）增高；而与2K1C组比较，NCBEE、NCBAE的干预可使血清NO浓度、SOD、GSH-Px活力增高，LDH活力、MDA浓度降低。前述研究结果提示，NCBEE、NCBAE可能通过对SBP、心室肥厚、凋亡和各血清指标的调节，改善2K1C高血压所致心脏损害。
　　第三部分：2K1C模型组血清代谢组学鉴定出13种化合物，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖蛋白、不饱和脂类、肌酸、β-羟丁酸、丙酮酸、柠檬酸。其中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸含量降低，α-葡萄糖、β-葡萄糖、糖蛋白、不饱和脂类降低；肌酸、β-羟丁酸、丙酮酸、柠檬酸的含量增高，较Sham组差异均有统计学意义。然而，NCBEE、NCBAE的干预可使2K1C大鼠血清亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸增高；NCBAE还可使缬氨酸、苯丙氨酸含量增高，表明药物的干预对体内氨基酸代谢有一定的改善作用。NCBEE、NCBAE使血清糖蛋白、α-葡萄糖、β-葡萄糖含量增高，β-羟丁酸减低；NCBEE可降低血清丙酮酸、柠檬酸和肌酸。此外，NCBEE还可使血清不饱和脂类含量增高。
　　结论：
　　第一部分： NCBEE和NCBAE可改善AngⅡ损伤CMVECs的活力，对细胞凋亡有一定的抑制效应，其机制可能与上调Bcl-2、下调caspase-3表达水平有关，并可调节NO、MDA浓度及LDH、SOD、GSH-Px活力，发挥细胞保护作用。
　　第二部分：成功建立2K1C肾血管性高血压大鼠模型；NCBEE、NCBAE可能通过调节血压和血清NO、LDH、SOD、GSH-Px、MDA，及调控Bcl-2和caspase-3蛋白表达而发挥心脏保护效应，并在一定程度上逆转左室肥厚，改善心功能。
　　第三部分：2K1C模型组与Sham组间的差异性代谢物可能成为肾血管性高血压的疾病标志物；NCBEE、NCBAE对调节2K1C高血压大鼠体内氨基酸、糖、脂代谢，改善大鼠机体的病理代谢状态有一定的作用。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

第一部分 大鼠CMVECs的原代培养及甘松（NCBEE、NCBAE）对AngII损伤CMVECs的干预研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 2K1C肾血管性高血压模型的建立及甘松（NCBEE、NCBAE）对高血压大鼠心脏损害的干预研究

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 基于NMR不同剂量NCBEE、NCBAE对肾血管性高血压大鼠血清的代谢组学分析

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

致谢

参考文献

综述:高血压血管内皮细胞损伤机制及甘松研究现状

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表