新疆维吾尔族2型糖尿病危险因素调查及相关易感基因多态性分析与其机制研究

摘要

目的：明晰新疆地区维吾尔族人群中2型糖尿病（T2DM）发病的相关危险因素，探讨易感基因TCF7L2，HNF1B，JAZF1和KCNQ1的单核苷酸多态性及其他相关因素之间的交互作用与T2DM之间的关联，进而体外实验研究TCF7L2剪切异构体对肝细胞和胰岛细胞代谢的影响，阐明糖尿病发病的分子机制，为早期发现新疆地区维吾尔族T2DM高危人群、制定科学防控策略及探索靶向治疗提供科学依据。
　　方法：采用病例对照研究设计，选择2013年3月至2015年12月期间于新疆医科大学第一附属医院及第五附属医院、喀什地区第一医院2型糖尿病住院患者1,000例，对照组选择同期在该医院体检中心体检的非糖尿病病人的维吾尔族人群1010例。收集病例组与对照组研究对象的社会经济、人口学、疾病史、吸烟、饮酒等信息。测量研究对象的身高、体重、腰围、臀围生理指标，检测血压，血脂、血糖、糖化血红蛋白等生化指标。采用SPSS17.0软件进行数据的统计分析。应用logistic回归模型分析维吾尔族2型糖尿病的相关环境危险或保护性因素。然后抽取293名病例组与258名对照组人群血样进行易感基因多态性与T2DM人群患病风险的关联性分析。检测T2DM13个易感基因的30个单核苷酸多态性位点位点（SNPs）进行血细胞基因组DNA提取测序，通过Mulitiplex Snapshot多重SNP分型技术（iMLDR? SNP）对每一个样本的每一个检测位点多态性进行了分型。选择符合Hardy-Weinberg平衡的位点进行进一步分析，采用χ2检验分析各位点基因型和等位基因在病例组与对照组之间分布的差异；采用Logistic回归分析易感基因多态性与其他相关因素之间的交互作用与维吾尔族人群中T2DM的关联。在细胞机制功能方面研究，细胞培养人正常肝细胞系HL-02，肝癌细胞系HepG2，Hep3B2.1-7以及人胰岛细胞HPDE6-C7，人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2，PANC-1，BXPC-3，通过细胞增值实验、细胞转染、流式细胞检测等方法观察TCF7L2转录异构体对细胞增殖、凋亡的影响，之后通过实时定量RT-PCR验证TCF7L2转录异构体对人β胰岛细胞的胰高血糖素样肽-1（GLP-1），细胞周期调控蛋白D1（Cyclin D1，CCND1），胰岛素（insulin）和胰岛素促进因子（pdx-1）的mRNA表达水平的影响，从而验证TCF7L2剪切异构体的功能。
　　结果：
　　1、识别新疆地区维吾尔族人群中2型糖尿T2DM患病相关危险因素。2型糖尿病组中男性人数为630人（31.3％），女性为380人（18.9%），对照组中男性人数为628人（31.2%），女性372人（18.5%）。两组在年龄组成（χ2=6.00，P=0.318）和性别构成（χ2=0.04，P=0.843）方面差异无统计学意义，但两组之间在身体质量指数（BMI）和腰臀比（WHR）、文化程度和收入水平、高血压和非酒精性脂肪性肝（NAFLD）、冠心病等相关病史和糖尿病家庭史、饮酒和吸烟等生活习惯方面差异存在统计学意义。通过logistic回归分析明确高腰臀比是危险因素，相对患2型糖尿病的风险OR值为1.019（95%CI：1.005-1.034），说明腰围高一个单位组患者发生糖尿病的风险是低一个单位组患者发生糖尿病风险的1.019倍。在收入水平上，月收入为2000-3500元组、3500-5000元组与月收入为2000元以下的组相比，发生糖尿病的风险高，两组与月收入2000以下相比的OR值分别为2.314（95%CI：1.300-4.118）、3.498（95%CI：1.977-6.192）。说明在一定收入范围内，高月收入反而是危险因素。通过比较相关疾病史如高血压、冠心病、NAFLD、家族糖尿病史、吸烟、饮酒、体育锻炼等因素与T2DM发生之间的关系，结果显示高血压、冠心病、DM家族史、NAFLD、饮酒的OR值分别为4.556（95%CI：2.509-8.274）、4.039（95%CI：2.333-6.990）、6.410（95%CI：3.212-12.789）、3.581（95%CI：2.097-6.118）、1.735（95%CI：1.193-2.522）。说明高血压、冠心病、DM家族史、NAFLD、饮酒都是糖尿病发生的高危因素。而吸烟、体育锻炼的OR值分别为0.035（95%CI：0.014-0.089）、0.544（95%CI：0.350-0.843），说明吸烟、体育锻炼是糖尿病的保护因素。
　　2、TCF7L2，HNF1B，JAZF1和KCNQ1基因多态性及其他相关因素之间的交互作用与T2DM之间的关联
　　（1）通过对易感基因分型检测、标签SNPs筛选，选择4个基因TCF7L2（Transcription factor7-like2），HNF1β，JAZF1和KCNQ1的4个多态性位点rs290487、rs864745、rs231362、rs4430796进行分析。通过Hardy-Weinber平衡检验，对照组中4个位点的基因型频率分布上无明显差异（P均＞0.05）。在新疆维吾尔族人群中，分别是rs290487（X2=0.350，P=0.840）、rs4430796（X2=1.751，P=0.417）、rs864745（X2=0.000， P=1.000）和rs231362（X2=0.073，P=0.972），说明此研究对照组中在4个位点的基因频数分布与全人群的基因频数分布差异无统计学意义，对照组样本有人群代表性。
　　（2）易感基因4个位点的基因型在糖尿病组和对照组中的差异分布及性别分层分析
　　①易感基因SNPs的4个位点的基因型的分布差异分析。采用卡方检验分析TCF7L2基因rs290487位点基因型在维吾尔族 T2DM和对照人群中的分布差异，结果发现该位点的CC、CT及TT基因型在组间分布存在差异，具有统计学意义。HNF1β基因rs4430796位点基因型在维吾尔族 T2DM和对照人群中的分布差异，结果发现该位点的AA、AG及GG基因型在组间分布存在差异。JAZF1基因rs864745位点基因型在维吾尔族 T2DM和对照人群中的分布差异，结果发现该位点的CC、CT及TT基因型在组间分布存在差异。KCNQ1基因rs231362位点基因型在维吾尔族 T2DM和对照人群中的分布差异，结果发现该位点的GG、GA及AA基因型在组间分布存在差异。
　　②易感基因SNPs的4个位点的基因型的分布差异的性别分层分析。在男性群体和女性群体中，采用卡方检验分别分析TCF7L2基因rs290487位点、JAZF1基因rs864745位点和KCNQ1基因rs231362位点在维吾尔族 T2DM和对照人群中，HNF1β基因rs4430796位点在维吾尔族整体人群和女性人群的分布差异均具有统计学意义。
　　（3）易感基因SNPs的4个位点的各遗传模型分析。通过维吾尔族 T2DM和对照组比较，易感基因SNPs的基因位点的遗传模型发现，rs231362、rs290487、rs864745和rs231362位点的遗传模型均有显著差异。
　　①T2DM病例组与对照组中rs231362基因型分析。T2DM组携带rs231362的等位基因A者是携带等位基因G者发生T2DM的风险的0.351倍、而在显性基因模型中显示，携带GA+AA者是携带显性基因GG者患病风险的0.281倍，具有统计学意义以及隐性基因模型。
　　②T2DM病例组与对照组中 rs290487基因型分析。rs290487的等位基因C者是携带等位基因T者发生T2DM的风险的0.280倍、而在显性基因模型中显示，携带TC+CC者是携带显性基因TT者患病风险的0.116倍，具有统计学意义，在隐性基因模型中显示，具有CC者是TC+CC患T2DM的风险的0.226倍。
　　③T2DM病例组与对照组中rs4430796基因型分析。rs4430796的等位基因模型显示T2DM组携带等位基因G者是携带等位基因A者发生T2DM的风险的0.719倍，具有统计学意义，而在显性基因模型中显示，携带GA+GG者是携带显性基因AA者患病风险的0.570倍，具有统计学意义。
　　④ T2DM病例组与对照组中rs864745基因型分析， rs864745的等位基因模型显示，T2DM组携带等位基因C者是携带等位基因T者发生T2DM的风险的0.480倍、而在显性基因模型中显示，携带TC+CC者是携带显性基因TT者患病风险的0.421倍，在隐性基因模型结果中显示，具有CC者是TC+TT者患T2DM风险的0.301倍，具有统计学意义。
　　（4）基因多态性位点与环境因素的交互作用关系
　　①采用logistic回归模型，在调整其他因素后发现KCNQ1基因rs231362位点在显性模型下与体育锻炼存在交互作用。其中，与KCNQ1基因rs231362位点GG基因型且不进行体育锻炼个体相比， GA+AA基因型且不进行体育锻炼个体、GA+AA基因型且体育锻炼个体的2型糖尿病患病风险均较低。
　　②采用logistic回归模型，在调整其他因素后发现TCF7L2基因rs290487位点在显性模型下分别与吸烟、饮酒和高血压存在交互作用。其中，与TCF7L2基因rs290487位点CC基因型且不吸烟个体对比，CT+TT基因型且不吸烟个体、CT+TT基因型且戒烟个体、CT+TT基因型且吸烟个体的2型糖尿病患病风险都较高。同时，与该位点CC基因型且不饮酒个体对比，CT+TT基因型且不饮酒个体、CT+TT基因型且戒酒个体、CT+TT基因型且饮酒个体的2型糖尿病患病风险都较高。以及与该位点CC基因型且血压正常个体相比，CT+TT基因型且血压正常个体、CT+TT基因型且高血压患者的2型糖尿病患病风险均较高。
　　③采用logistic回归模型，在调整其他因素后发现JAZF1基因rs864745位点在隐性模型下分别与血脂异常和体育锻炼存在交互作用。其中，与JAZF1基因rs864745位点TT+TC基因型且血脂正常个体对比，CC基因型且血脂正常个体的2型糖尿病患病风险较低，而TT+TC基因型且血脂异常个体的2型糖尿病患病风险较高。以及与该位点TT+TC基因型且不进行体育锻炼个体相比，CC基因型且不进行体育锻炼个体、CC基因型且进行体育锻炼个体的2型糖尿病患病风险均较低。
　　④采用logistic回归模型，在调整其他因素后未能发现HNF1β基因rs4430796位点与吸烟、饮酒、高血压、血脂异常、BMI、糖尿病家族史、体育锻炼存在交互作用。
　　3、TCF7L2剪切异构对肝及胰岛细胞关键基因表达和增殖、凋亡影响。通过TCL7L2在肝和胰8个细胞株中剪切异构方面研究，证明细胞中存在exon4和exon5外显子缺失的转录产物，其中胰岛细胞株HPDE6-C7细胞株中缺失exon4和exon5外显子的剪切体最为明显，而人正常肝细胞HL02和胰岛β细胞表达exon4和exon5外显子的剪切体的能力相对较弱。所有细胞株中没有观测到8号外显子的剪切异构体存在。通过构建EGFP过表达载体并转染人胚胎肝细胞HL-02和胰岛β-细胞，随后通过MTT检测细胞增殖情况，流式检测细胞凋亡情况发现TCF7L2影响肝细胞和胰岛细胞的增殖和凋亡。相对于野生型TCF7L2组，缺失exon4/exon5的TCF7L2剪切异构体组对人肝细胞增殖促进能力减弱，同时抑制凋亡的保护能力减弱。而野生型TCF7L2组以及缺失exon4/exon5的TCF7L2剪切异构体组对人胰岛细胞增殖促进能力都不明显，但其抑制凋亡的保护能力减弱，同时相对于野生型TCF7L2组，缺失exon4/exon5的TCF7L2剪切异构体组对胰岛细胞关键基因如GLP-1mRNA、insulin mRNA、pdx-1 mRNA的表达促进能力减弱，对CCND-1 mRNA的表达三组间无统计学差异。
　　结论：
　　1、新疆维吾尔族糖尿病组与对照组相比，BMI、腰臀比显示出差异。维吾尔族人群中吸烟和体育锻炼是糖尿病的保护性因素，而一定范围内的高收入，合并高血压、冠心病、NAFLD以及有家族糖尿病病史，及饮酒均是糖尿病的危险因素。维吾尔族男性糖尿病者的腰围、臀围、腰臀比、尿酸、血肌酐、总胆固醇明显高于女性糖尿病患者，高密度脂蛋白（HDL）水平显著低于女性糖尿病患者。
　　2、新疆维吾尔族2型糖尿病人群和对照人群中KCNQ1基因rs231362位点， TCF7L2基因rs290487位点、HNF1β基因rs4430796位点、和JAZF1基因rs864745位点这4个位点的各基因型分布存在统计学差异。KCNQ1基因的rs231362的G等位基因和基因型GG， JAZF1基因的rs864745位点T等位基因和基因型TT， TCF7L2基因的rs290487的T等位基因和基因型TT，HNF1β基因rs4430796位点A等位基因和基因型AA可能与新疆维吾尔族人群T2DM发病风险有关。KCNQ1基因rs231362位点与体育锻炼存在交互作用，TCF7L2基因rs290487位点分别与吸烟、饮酒和高血压存在交互作用，JAZF1基因rs864745位点分别与血脂异常和体育锻炼存在交互作用。
　　3、TCF7L2在人肝及胰腺来源的细胞系中都存在exon4/exon5的异构剪切。相对于野生型TCF7L2，缺失exon4/exon5的TCF7L2剪切异构体对人肝细胞增殖促进能力减弱，同时抑制凋亡的保护能力减弱。野生型TCF7L2以及缺失exon4/exon5的TCF7L2剪切异构体对人胰岛细胞增殖促进能力都不明显，但其抑制凋亡的保护能力减弱。相对于野生型TCF7L2，缺失exon4/exon5的TCF7L2剪切异构体对胰岛细胞关键基因如胰岛素合成基因和细胞周期相关基因表达促进的能力减弱。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

第一部分 新疆地区维吾尔族糖尿病调查及相关危险因素分析

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 新疆维吾尔族糖尿病与基因多态性相关性

1 研究内容与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 TCF7L2剪切异构对肝及胰岛细胞关键基因表达和增殖、凋亡影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

致谢

参考文献

附录

综述:TCF7L2单核苷酸多态性与糖尿病的遗传易感

攻读博士学位期间获得的学术成果

个人简历

导师评阅表