RNA干扰hTERT基因对人恶性黑素瘤A375细胞增殖的影响

摘要

目的：建立特异性hTERT基因沉默模型并探讨靶向调控hTERT基因对人恶性黑素瘤A375细胞增殖能力的影响。方法：培养人恶性黑素瘤A375细胞且通过细胞STR分型鉴定确认细胞及交叉污染情况，将不同浓度（0、5.0、15.0、35.0nmol/L）的携带绿色荧光标记的特异性siRNA与不同体积（1.5、3.0、4.5μl）的转染试剂Hiperfect转染人恶性黑素瘤A375细胞，细胞的转染效率采用荧光显微镜判定，选出最佳的siRNA浓度和转染试剂体积；合成4条hTERT-siRNA（hTERT-siRNA-203、hTERT-siRNA-210、hTERT-siRNA-217、hTERT-siRNA-224）在最佳转染条件下分别转染人恶性黑素瘤A375细胞，24h后提取总mRNA，通过qPCR筛选干扰效率最佳的hTERT-siRNA，利用MTT法观察靶向沉默hTERT基因对黑素瘤细胞增殖能力的影响。结果：0、5.0、15.0、35.0nmol/L携带绿色荧光标记的特异性siRNA分别与1.5μlHiperfect转染人恶性黑素瘤A375细胞后，各组内转染效率分别为1.44%?0.49%、37.19%?0.09%、23.46%?0.17%、16.63%?0.03%；3.0μlHiperfect的转染效率分别为3.07%?0.97%、73.46%?0.03%、34.41%?0.07%、29.16%?0.05%；4.5μlHiperfect的转染效率分别为1.59%?0.91%、21.74%?0.04%、29.04%?0.01%、31.15%?0.26%，各特异性siRNA组与各Hiperfect组比较，存在差异且有统计学意义（F=57.21，P＜0.05），5.0nmol/L siRNA与3μlHiperfect的转染效率明显高于其他各组（均P＜0.05），转染效率最佳。各个hTERT-siRNA组，阴性对照组及空白组hTERT mRNA相对表达量分别为0.36?0.03、0.79?0.07、0.57?0.01、0.64?0.03、0.93?0.05、1.00?0.07，以上三组之间比较，差异有统计学意义（F=22.78，P＜0.05），hTERT-siRNA-203 hTERT mRNA的表达量明显低于其他组（均P＜0.05），干扰效率最佳。hTERT-siRNA-203转染24h、48h、72h组的细胞增殖抑制率明显增高（分别为20.45%?2.09%，31.53%?2.44%，45.40%?2.91%），与阴性对照组（2.75%?0.54%，5.05%?1.18%，8.45%?1.42%）、空白对照组（3.93%?1.09%，6.84%?2.46%，12.23%?2.84%）比较，有统计学意义（P＜0.01）。结论：hTERT-siRNA-203可使hTERT mRNA的表达显著下调，hTERT基因沉默模型成功建立，靶向调控hTERT可显著抑制恶性黑素瘤A375细胞的增殖能力。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

实验内容与方法

1 材料和试剂

2 实验方法

3 质量控制

4 统计方法

附：技术路线图

结果

1 人恶性黑素瘤A375细胞STR鉴定

2 携带绿色荧光标记的特异性siRNA转染人恶性黑素瘤A375细胞

3 人恶性黑素瘤A375细胞中hTERT基因的表达情况

讨论

1 hTERT与肿瘤

2 RNA干扰与hTERT

3 RNA干扰hTERT基因对黑素瘤细胞增殖能力的分析

小结

致谢

参考文献

综述:恶性黑素瘤的免疫治疗研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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