牛赤羽病病毒重组N蛋白抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制

摘要

为获得赤羽病病毒(AkabaneVirus，AKAV)核衣壳(N)蛋白重组抗原作诊断应用研究，经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段，将其克隆到pMD18-T载体。用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a(+)进行连接，然后转化感受态细胞。将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达、融合蛋白纯化及活性鉴定。N基因ORF全长702bp，编码233氨基酸，通过SDS-PAGE和Westernblotting检测，证实重组菌株可高效表达有免疫学活性的分子量约27kD的可溶性融合蛋白，用薄层扫描仪分析其最高表达量可占可溶性菌体蛋白总量的58.5％。工程菌经超声波裂解高速离心后上清在天然状态下用ProBondTMPurificationSystem(含Ni2+)纯化，经过对纯化条件的优化，融合蛋白纯度可达99％。将纯化的重组N蛋白免疫兔，获得了重组N蛋白的抗血清。以此抗血清作一抗，利用间接荧光抗体法在AKAV感染的BHK21培养细胞和攻毒的乳鼠脑组织中特异性地检测到了AKAV抗原，这为赤羽病的病原学诊断提供了简便的检测方法。以纯化的重组N蛋白作为诊断抗原，研制了检测牛血清特异性AKAVN蛋白抗体的间接ELISA诊断试剂盒。经研究确定最佳抗原包被量为1μg/100μl/孔，样品稀释度为1：100，兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1：8000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验分别对云南(89份)、内蒙(100份)牛血清样本进行检测，以中和试验为参照，通过统计学处理，得出临界值分别为0.411和0.303，二者符合率分别为72.7％(56/77)和91.4％(85/93)。试剂盒在37℃保存3天，对敏感性无明显影响。本研究初步建立了赤羽病简便、快速的诊断方法。

目录

独创性声明及关于学位论文使用授权的说明

摘要

英文缩略词表

前言

文献综述 赤羽病研究进展

研究报告

实验一赤羽病病毒N蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

实验二赤羽病病毒间接荧光抗体快速检测方法的初步研究

实验三重组赤羽病病毒N蛋白抗原间接ELISA诊断试剂盒的研制

结论

参考文献

附 录

致谢

作者简介