共表达禽流感病毒HA5和HA9基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究

摘要

本试验构建了禽流感HA5和HA9基因共表达禽痘病毒转移载体，经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化，获得了遗传形状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞 (CEF) 的DNA进行PCR扩增，获得1.7k6的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞，分别用H5亚型和H9亚型AIV多克隆血清作一抗，碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测，结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。 用该重组病毒进行鸡翅刺种免疫60日龄SPF鸡，免疫3周后，每只鸡用50XLD H5亚型HPAIV攻毒，H5免疫组无一发病和死，攻毒保护率100﹪；H9组用50XLD H9亚型LPAIV攻毒，攻毒保护率20﹪；对照组全部发病并在攻毒后3-9天相继死亡，发病率和死亡率均为100﹪。H5抗体效价检测结果表明重组病毒免疫组鸡在免疫后7大即可检测到高效价的HI5抗体，抗体效价在免疫后14天达到高峰，随后在较高水平上缓慢下降，攻毒对抗体效价及其变化没有影响；而H9抗体检测效价较低，平均1.2Log2。通过本试验研究，获得了遗传性状稳定，表达AIV HA5和HA9基因重组禽痘病毒，SPF鸡免疫和攻毒试验结果表明，重组病毒疫苗能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应，对H5强毒攻击产生强的免疫保护，为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础。

目录

文摘

英文文摘

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第一章 文献综述

第二章试验材料与方法

2.1试验材料

2.1.1 质粒

2.1.2载体病毒

2.1.3 SPF鸡胚

2.1.4酶

2.1.5感受态菌种

2.1.6 DMEM细胞培养液

2.1.7 X-gal

2.1.8消化用0.25％胰酶的配置

2.1.9低溶点琼脂糖

2.1.10 DNA回收、纯化与转染试剂盒

2.1.11 SPF鸡血细胞

2.1.12培养基

2.1.13试验用的各种试剂

2.1.14常用仪器

2.2方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.1 pSY681HA5-LacZ和pSY538HA9基因质粒的克隆

2.2.2共表达HA5和HA9基因重组痘病毒转移载体的构建

2.2.3转染

2.2.4重组病毒的筛选与纯化

2.2.5重组病毒鉴定

2.2.6试验动物免疫

2.2.7攻毒

第三章结果

3.1 pSY681HA5-LacZ和pSY538HA9基因质粒的克隆鉴定

3.2共表达HA5和HA9基因重组痘病毒转移载体的鉴定

3.3转染

3.4重组病毒的筛选与纯化

3.5重组病毒鉴定

3.5.1重组病毒PCR鉴定

3.5.2重组病毒HA5，HA9基因表达产物Western-blot鉴定

3.6试验动物免疫

3.6.1免疫

3.6.2临床观察

3.7攻毒

3.7.1攻毒后结果

3.7.2抗体检测

3.7.3病毒分离检测结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

致谢

作者简介