堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库构建与抗原基因筛选

摘要

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防，但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。研制高效安全抗球虫病基因工程疫苗的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。 本研究首先利用传统生物学方法对实验所选的堆形艾美耳球虫(Eimeria acervulina)虫株进行了鉴定，包括潜在期、寄生部位、最短孢子化时间、卵囊形状、卵囊大小及孢子囊大小等。利用SMARTTM eDNA文库构建试剂盒成功构建了堆形艾美耳球虫孢子化卵囊eDNA文库，文库库容量为4.7×106pfw/mL，重组率为98％；扩增后的文库滴度为4.4×1010pfu/mL插入片段平均大小约为1000 bp。用堆形艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性抗原免疫兔血清筛选构建的eDNA文库，获得6个阳性克隆，PCR鉴定1～3号阳性克隆的插入片段大小约为1000bp，4～6号克隆约为1500 bp。随机选取1个阳性克隆(dui10)进行测序，将所得序列与GenBank进行对比分析，发现dui10为-新基因(GenBank登录号：EU590120)，该基因有1个完整开放阅读框，编码163个氨基酸，生物信息学分析显示该新基因含有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶II磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点。另外，利用PCR方法从构建的堆形艾美耳球虫孢子化卵囊eDNA文库中扩增出了巨噬细胞移动抑制因子基因(macrophage migration inhibitory factor，MIF)，将该基因连接到原核表达载体pET28a(+)，成功构建了重组表达质粒pET28a-MIF，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，利用镍亲和层析柱纯化重组蛋白pET28a-MIF，Western-blot分析，结果表明重组蛋白pET28a-MIF具有良好的抗原性。 本研究成功构建了堆形艾美耳球虫孢子化卵囊eDNA文库，通过免疫筛选获得1个新基因，从该eDNA文库中成功克隆了MIF，并在原核表达系统中进行表达。研究结果为鸡球虫候选基因工程疫苗靶分子和新治疗药物靶标的筛选奠定了基础。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章文献综述

1.1堆形艾美耳球虫研究进展

1.2 cDNA文库及其在原虫研究中的应用

第二章利用生物学方法鉴定堆形艾美耳球虫

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

第三章堆形艾美耳球虫cDNA文库的构建及鉴定

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

第四章堆形艾美耳球虫cDNA文库的筛选

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

第五章堆形艾美耳球虫新基因的克隆与分析

5.1材料和方法

5.2结果

5.3讨论

第六章堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达

6.1材料和方法

6.2结果

6.3讨论

第七章结论

参考文献

附录

致谢

作者简历