乌鲁木齐地区奶牛隐性乳房炎主要致病菌分析及金黄色葡萄球菌毒力基因检测的研究

摘要

本研究以新疆乌鲁木齐地区的三个奶牛场隐性乳房炎患牛为实验对象，共分离鉴定出21种91株引起奶牛乳房炎的主要病原菌，其中葡萄球菌28株(30.78％)，链球菌21株(23.07％)，杆菌25株(27.48％)，其他细菌17株(18.67％)，并用肠道细菌基因间重复序列-PCR(ERIC-PCR)方法对这49株金黄色葡萄球菌进行了基因分型研究。ERIC-PCR分型结果显示：49株金黄色葡萄球菌可扩增出3～10条带，共分为4个聚类群，在同一牛场中的分离株存在不同的基因型；而不同牛场中的分离株也可属于同一基因型。这种结果提示，在不同环境下同一种病原菌的基因型存在一定差异，可能存在多个金黄色葡萄球菌的流行株。 将新疆褐牛和荷斯坦牛两个不同品种对奶牛乳房炎的影响进行了比较，同时对不同品种牛体细胞数与菌落形成单位(CFU)、体细胞数与不同年龄进行了统计分析。结果表明：两种牛感染病原菌种类稍有差别且新疆褐牛感染葡萄球菌的机率明显高于荷斯坦牛；荷斯坦牛比新疆褐牛更容易患乳房炎；新疆褐牛、荷斯坦牛体细胞在小于20万/mL时均与体细胞大于50万/mL时的CFU值呈显著差异(P<0.05)，而这两个品种牛的体细胞在20-50万/mL时分别与体细胞小于20万/mL、大于50万/mL时的CFU值均无显著差异(P>0.05)，初步推测体细胞数和细菌总数之间没有必然联系，还受其它因素影响：此外，随着年龄增长，褐牛和荷斯坦牛的SCS都呈上升趋势，且不同品种间的SCS差异显著。 本研究还建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法。在16srDNA区域设计了特异性引物，建立了检测葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的葡萄球菌的细菌最小浓度为103CFU/mL，检测链球菌和大肠杆菌的细菌最小浓度分别为103CFU/mL和104CFU/mL。对送检的乳房炎奶样25份直接进行PCR检测，葡萄球菌阳性15份，大肠杆菌阳性10份，链球菌5份。 并用PCR方法对新疆乌鲁木齐周边3个奶牛场奶牛乳汁中分离得到的49株金黄色葡萄球菌的entA、tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb8种毒力基因进行了分子流行病学调查。结果表明：tsst-1、nuc、clfA、fnbA、fnbB、hla、hlb、entA毒力基因的检出率分别为4％、59.2％、63.3％、69.4％、22.5％、46.9％、53.1％、0％，且以clfA、fnbA为主要检出毒力基因。 同时用30种药物对19类细菌进行药敏试验，结果表明：在奶牛隐性乳房炎中应用较多的青霉素、四环素等对常见的致病菌几乎无效，而左氧氟沙星、呋喃妥因、头孢噻肟、阿米卡星则显示出较好的抑菌作用。

目录

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论文说明：缩略语中英文对照表

声明

第一章研究背景

1.1奶牛乳房炎的研究进展

1.1.1概念和分类

1.1.2危害性

1.1.3流行病学调查

1.1.4病因分析

1.1.5发病机理

1.1.6奶牛乳腺的药理学机制和主要病原菌的耐药性研究

1.2乳房炎病原菌基因水平研究进展

1.2.1乳房炎病原菌的功能基因组学研究

1.2.2 rDNA(rRNA)在病原菌鉴定中的应用

1.3金黄色葡萄球菌的概述

1.3.1生物学特性

1.3.2致病性

1.4本试验中涉及的分子生物学方法

1.4.1多重PCR技术

1.4.2肠杆菌科基因间重复序列分型技术

1.5本研究的目的意义

第二章乌鲁木齐地区奶牛隐性乳房炎病原菌的初步分离鉴定

2.1实验材料

2.1.1样品来源

2.1.2培养基及试剂

2.1.3主要仪器与设备

2.1.4主要分析工具软件

2.1.5试剂配制

2.2实验方法

2.2.1奶样采集

2.2.2隐性乳房炎检测

2.2.3常规细菌学鉴定

2.2.4分子生物学快速鉴定

2.2.5金黄色葡萄球菌种引物特异性扩增

2.2.6金黄色葡萄球菌的基因分型研究

2.3结果与分析

2.3.1隐性乳房炎检测结果

2.3.2细菌分离鉴定结果

2.3.3不同品种对奶牛乳房炎的影响

2.3.4不同品种牛体细胞数与细菌计数统计分析

2.3.5不同品种牛病原菌分离培养结果

2.3.6不同年龄褐牛、荷斯坦牛体细胞数对乳房炎的影响

2.3.7分子检测结果

2.3.8金黄色葡萄球菌分子生物学鉴定

2.3.9金黄色葡萄球菌REIC基因分型结果

2.4讨论

2.4.1细菌分离鉴定

2.4.2用16S rDNA设计引物检验葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的可行性

2.4.3多重PCR方法检测的敏感性

2.3.4 ERIC-PCR技术

第三章奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子检测

3.1试验材料

3.1.1试验样本和主要试剂

3.1.2主要仪器设备

3.1.3主要分析工具软件

3.1.4 fnbA、fnbB、hla、hlb、entA、tsst-1、nuc、clfA毒力基因的引物设计

3.2实验方法

3.2.1 DNA模板制备

3.2.2 fnbA、fnbB、hla、hlb、entA、tsst-1、nuc、clfA毒力基因PCR扩增

3.2.3 PCR扩增体系

3.2.4 PCR产物的电泳检测

3.3结果与分析

3.3.1金黄色葡萄球菌毒素基因PCR检测结果

3.3.2毒力基因的分布

3.4讨论

第四章奶牛乳房炎主要病原菌的药敏试验

4.1材料

4.1.1菌株

4.1.2 ATB药敏试条

4.1.3主要仪器设备

4.2实验方法

4.2.1菌种的复苏

4.2.2药敏试验

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章结论

参考文献

致谢

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