新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus)抗冻蛋白基因的克隆

摘要

新疆沙冬青源于第三纪，为亚洲中部荒漠地区唯一的常绿阔叶灌木，已被列为国家二级濒危保护植物。四季常绿，非常抗寒和耐旱，能耐-30℃以下的低温，是我国特种植物化学成分(如抗冻蛋白AFP)研究、提取和转接的珍贵材料。 实验利用反转录PCR(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)策略，克隆获得新疆沙冬青AFP基因开放阅读框(ORF)全长序列。所得结论如下： 1.以新疆沙冬青幼苗为研究材料，利用RT-PCR为基础克隆手段，结合RACE策略得到新疆沙冬青AFP基因的ORF。此序列全长为609bp，编码203个氨基酸。同源性分析结果表明，该ORF与其同属的蒙古沙冬青AFP基因序列同源性为65.7％，其编码的蛋白质氨基酸序列同源性为76.68％。 2.利用新疆沙冬青幼苗的基因组DNA，设计扩增AFP基因的ORF引物，所获片段的测序结果与利用其cDNA为模板获得的ORF序列完全一致，说明新疆沙冬青AFP基因无内含子，其基因是连续的。同时也说明该基因在植物进化过程中高度保守，可以作为研究植物进化历程的一个分子标尺。 3.利用相关分子生物学软件对新疆沙冬青AFP的二级结构进行分析，结果表明AFP中存在许多无规则卷曲，占72.9％，同时β-折叠结构的比例(19.21％)明显高于α-螺旋(7.88％)。说明这些无规则卷曲与β-折叠可能与该蛋白的抗冻性能有关。

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论文说明：缩略词表

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第一章 植物抗冻蛋白的研究概况

1.1新疆沙冬青研究概况

1.1.1沙冬青的种类

1.1.2新疆沙冬青的分布

1.1.3新疆沙冬青生物学特性

1.2抗冻蛋白研究概况

1.2.1抗冻蛋白

1.2.2抗冻蛋白特性

1.2.3抗冻蛋白的作用

1.2.4抗冻蛋白国内外研究进展

1.2.5沙冬青抗冻蛋白的研究

1.3实验中相关技术简介

1.3.1 RT-PCR技术简介

1.3.2 RACE技术简介

1.4本研究工作的目的和意义

第二章 实验材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1植物材料

2.1.2试剂

2.1.3实验仪器

2.2实验方法

2.2.1 AFP基因保守区片段克隆

2.2.2 RACE反应

2.2.3 AFP基因ORF的克隆

2.2.4AFP基因及蛋白质序列分析

第三章 结果与分析

3.1新疆沙冬青总RNA的提取

3.2AFP基因cDNA保守区序列及RACE结果分析

3.3新疆沙冬青AFP基因ORF克隆

3.4新疆沙冬青AFP基因cDNA的克隆和序列分析

3.4.1新疆沙冬青AFP基因的核苷酸序列分析

3.4.2新疆沙冬青AFP蛋白质序列分析

第四章 讨论

4.1 RT-PCR实验过程中遇到的问题

4.2反向PCR在本实验中的应用

4.3新疆沙冬青AFP基因的克隆

结 论

参考文献

附录 溶液配制方法

致 谢

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