激活蛋白PeaT1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性

摘要

激发子是目前生防领域中研究最热门的生物分子之一，这种生物分子最大的特点就是对病原菌或昆虫没有直接的杀伤作用，而是通过提高植物自身的“免疫”能力来达到抗病和抗虫效果的，另外，一些激发子还具有抗逆和促生长的作用，所以激发子是目前十分理想的生防材料之一。虽然人们已经发现了许多类型的激发子，比如：寡糖、脂类、肽、糖肽、蛋白质和糖蛋白等，但是关于它们是如何在植物上起作用的机理还并不十分清楚，尤其是对起广谱抗性的激发子。本文重点研究了一种蛋白激发子PeaT1在烟草细胞上的作用位点以及该位点的生化特性。首先用极低浓度的PeaT1处理烟草悬浮细胞，发现PR -1a基因的转录被诱导增强，同时用相同浓度的PeaT1溶液处理烟草植株，不同时间取样发现酸性PR蛋白被诱导表达，这种现象说明烟草细胞上存在某种组分可以接收并识别来自胞外的信号。为了搞清楚这种组分，本试验采取了多种标记方法对PeaT1的作用位点进行追踪，主要结果如下：（1）利用荧光素FITC标记纯化的PeaT1蛋白分子并与烟草悬浮细胞孵育，激光共聚焦显微镜观察发现PeaT1可以与悬浮细胞结合，并且结合在细胞表面，与对照相比较，这种结合具有特异性。（2）利用酶解法制备烟草细胞原生质体；对原核表达的PeaT1进行纯化，用高纯度的PeaT1蛋白做抗原制备兔多克隆抗体，利用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜观察发现PeaT1可以与烟草细胞的质膜结合。（3）为了进一步说明烟草细胞质膜上PeaT1结合位点的特性，一方面利用差速离心法制备烟草细胞膜囊系统，进一步通过亲水两相系统纯化出质膜膜囊；另一方面将激活蛋白PeaT1用放射性同位素125I标记，将两者进行孵育发现：PeaT1与烟草细胞质膜的结合具有专一性、饱和性和可逆性的特点。将PeaT1基因分段表达后，每段的结合能力显著下降，说明PeaT1与结合位点的结合需要其完整性。（4）为了进一步了解该结合位点的化学特性，在提纯的烟草细胞质膜和125I标记的激活蛋白PeaT1孵育结合以后，使用化学交联剂BS3将两者共价交联并进行SDS-PAGE，最后进行放射自显影发现：PeaT1可以与细胞质膜上的2个分子结合；分别将提纯的烟草细胞质膜加热或用蛋白酶处理。再将放射性同位素125I标记激活蛋白PeaT1与之结合，则结合不能发生，说明上述的2个分子具有蛋白质特性。（5）为了进一步获得激活蛋白PeaT1互作分子的更为详细的信息，利用双向电泳结合Far Western Blot以及生物质谱技术，鉴定出与激活蛋白PeaT1结合的分子可能为1个22 kDa的跨膜多肽。

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文摘

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论文说明:缩略词

声明

第1章 绪论

第2章 激活蛋白PeaT1的原核表达与纯化

第3章 激活蛋白PeaT1在烟草上的分子生物学效应

第4章 激活蛋白在烟草悬浮细胞上的结合位点研究

第5章 125I标记PeaT1研究结合位点的特性研究

第6章 蛋白组学方法研究PeaT1结合蛋白的性质

参考文献

致谢

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