猪圆环病毒2型新疆株的分离鉴定及感染性克隆的构建

摘要

猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的主要病原。该病毒可侵入机体的免疫系统,引起免疫抑制反应。
　　首先,采用PCR扩增技术,从新疆呼图壁某猪场病猪(疑似患有PMWS)的腹股沟淋巴结中检测到PCV2病毒DNA。对病料做匀浆处理后接种无PCV1污染的PK-15细胞,盲传5代后,用PCR方法仍然能够检测到PCV2核酸。应用间接免疫荧光方法从接毒细胞中观察到特异性的荧光反应,说明细胞中有PCV2病毒粒子存在。
　　其次,参考PCV2的全基因组序列(GenBank中收录),设计并合成一对引物。对分离的PCV2全基因组进行克隆测序,测序结果分析表明:该病毒分离株基因组全长为1767bp,与PCV1参考毒株(gu371908)的核苷酸序列同源性为76.8％,与其他PCV2参考病毒分离株的同源性为94.1%-99.3%。将该毒株命名为XJ-105株。
　　最后,参考PCV2的全基因组序列(GenBank中收录),设计并合成两对引物。通过PCR方法,用第一对引物从接种XJ-105病毒株的PK-15细胞中扩增获得PCV2全基因组,克隆入pMDSimple18-T载体中构建了质粒(T-PCV2)。然后将其作为模板,利用第二对引物,采用PCR定点突变的技术再扩增一个PCV2XJ-105株的全基因组,将其克隆入另一载体pBluescriptIISK(+),构建出质粒(K-PCV2),接着,将T-PCV2质粒中的PCV2全基因组连至突变后的PCV2全基因组的下游,构建出包含PCV2双基因组的重组质粒(K-2PCV2)。将获得的K-2PCV2转染至PK-15细胞,盲传五代后,利用RT-PCR和IFA方法检测,结果证实:本实验构建的PCV2感染性克隆在体外具有感染性。
　　本研究从患PMWS病猪腹股沟淋巴结中成功分离出一株PCV2病毒,并对分离的病毒进行全基因组克隆与序列测定。分析生成的系统发生进化树,结果表明:不同PCV分离株在进化差异性上表现明显,在此基础上构建了PCV2感染性克隆。这为研究PCV2的流行和变异,探索PCV2的致病机理、复制机制及疫苗的研制奠定了基础。

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英文缩略词表

第1章 概 述

1.1 PCV形态结构与理化特性

1.2 细胞培养特性

1.3 基因组结构特点

1.4 主要ORF的编码蛋白

1.5 病毒的致病性

1.6 PCV2的诊断

1.7 PCV2疫苗的研究进展

1.8 研究目的与意义

第2章 猪圆环病毒2型新疆株的分离鉴定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 猪圆环病毒2型新疆株感染性克隆的构建

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第5章 结 论

参考文献

附 录 常用缓冲液及培养基配方

致谢

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