牛环形泰勒虫表面抗原靶基因片段的筛选、鉴定及rELISA诊断方法的建立和应用

摘要

牛环形泰勒虫病是由环形泰勒虫（Theileria annulata）寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内引起的以贫血、稽留热为主要临床症状的一种蜱传血液性原虫病。迄今为止，还没有防治环形泰勒虫病的特效药物，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区呈逐年上升趋势，严重影响了养牛业的发展。因此，在牛环形泰勒虫病的防控工作中，在筛选病原表面抗原靶基因的基础上，研发高灵敏度及高通量的检测技术就显得尤为重要。本研究进行了如下三方面的研究工作:
　　(i)本研究，根据GenBank中已发表的牛环形泰勒虫Tams1基因序列，设计合成5对引物，采用基因工程技术分别扩增Tams1基因的全长基因(AE)、无N端及C端疏水区(BC)、仅缺乏N端疏水区(BE)片段，从而构建原核表达重组质粒。结果显示:成功地扩增了Tams1基因的AE、BC、BE等片段，构建了pGEX-4T-2-BE，pGEX-4T-2-BC，pGEX-4T-2-AE、pET-28a-BC，pET-28a-BE，pET-30a-BC，pET-30a-BE等7种原核表达重组质粒;测序结果表明克隆的Tams1序列及推导氨基酸序列与已发表的其它国家的虫株序列同源性可达99％，但与我国甘肃株的同源性分别为92％和86％，本实验可为用精制抗原诊断环形泰勒虫病的研究奠定基础。
　　(ii)本研究经基因工程方法，将重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)后，采用IPTG诱导法表达融合蛋白，并采用SDS-PAGE电泳法分析比较各蛋白的表达形式和表达量，对含筛选的高效可溶性表达质粒的重组菌进行诱导条件优化，最终对纯化的蛋白进行Western blotting检测。实验结果表明:成功表达出6种融合蛋白;SDS-PAGE检测筛选得出含pGEX-4T-2-BC（无疏水区靶基因）和pET-30a-BE（含C端疏水区靶基因）质粒的重组菌可分别高效表达GST-BC(53 ku)和His-BE(32ku)的可溶性蛋白;Western blotting表明纯化的GST-BC和His-BE融合蛋白具有良好的反应原性，可作为诊断抗原。
　　(iii)本实验，以纯化后的His-BE蛋白作为包被抗原，通过优化其反应条件后较成功地建立了检测牛环形泰勒虫抗体的间接ELISA方法;并进行了其敏感性、特异性、重复性等评测试验，应用建立的方法检测了样品(N=250)。结果显示:最佳抗原包被浓度为3μg/mL，包被时间为4℃过夜;最佳封闭液为3％脱脂乳;血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶100和1∶12000，封闭时间、血清作用时间和酶标抗体孵育时间都为1 h;底物作用时间为20 min;临界值为0.221。本试验所建立的间接ELISA方法具有一定的敏感、特异性，无交叉反应，其变异系数小于10％;应用建立的ELISA方法对吐鲁番地区的250份牛疑似血样进行了检测，结果显示环形泰勒虫感染率为39.2％，这结果被Western blotting检测方法验证，符合率为96.7％。该参数可为我区牛环形泰勒虫病的防治奠定基础。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词表

第1章 环形泰勒虫病的研究进展

1．1 环形泰勒虫病的概况

1．1．1 病原形态

1．1．2 生活史

1．1．3 免疫及生化指标影响

1．1．4 临床症状及病理变化

1．1．5 流行病学

1．1．6 防治

1．2 环形泰勒虫病诊断方法研究进展

1．2．1 病原学诊断

1．2．2 血清学诊断

1．2．3 分子生物学诊断

1．3 本课题研究的目的意义

第2章 环形泰勒虫新疆株Tams1基因片段的克隆表达及筛选

2．1 试验材料

2．1．1 血液来源

2．1．2 菌种及质粒

2．1．3 试剂及工具酶

2．1．4 主要仪器设备

2．2 试验力怯

2．2．1 牛环形泰勒虫新疆流行株的分离获得

2．2．2 环形泰勒虫Tams1基因序列分析及引物设计

2．2．3 全血基因组DNA的提取

2．2．4 环形泰勒虫Tams1基因的PCR扩增

2．2．5 PCR产物的回收与纯化

2．2．6 重组表达载体的构建

2．2．7 重组表达质粒的转化

2．2．8 重组表达质粒的筛选与鉴定

2．2．9 目的基因序列测定

2．2．10 重组表达质粒的诱导表达

2．2．11 高效可溶性表达重组质粒的筛选

2．2．12 诱导条件的优化

2．2．13 目的蛋白的纯化

2．2．14 Western blotting分析

2．3 结果与分析

2．3．1 牛环形泰勒虫新疆流行株的获得

2．3．2 牛环形泰勒虫Tams1基因的扩增

2．3．3 重组表达质粒的鉴定结果

2．3．4 目的基因Tams1的测序分析结果

2．3．5 高效可溶性表达重组质粒的筛选

2．3．6 诱导条件的优化结果

2．3．7 目的蛋白的纯化及鉴定

2．4 讨论与分析

2．4．1 Tams1基因亚克隆抗原位点的选择及序列分析

2．4．2 表达载体的选择

2．4．3 Western blotting分析

2．5 小结

第3章 牛环形泰勒虫病间接ELISA检测方法的建立及初步应用

3．1 试验材料

3．1．1 抗原及血清

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 临床样品来源

3．2 试验方法

3．2．1 His-BE蛋白的定量

3．2．2 间接ELISA方法的建立

3．3 结果与分析

3．3．1 His-BE蛋白浓度的测定

3．3．2 最佳包被缓冲液的选择结果

3．3．3 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定结果

3．3．4 包被条件的确定结果

3．3．5 最佳封闭液及封闭时间的确定

3．3．6 血清最佳作用时间的确定

3．3．7 酶标二抗最佳工作浓度和时间的确定

3．3．8 底物作用时间的确定

3．3．9 阴阳性临界值的确定

3．3．10 间接ELISA方法评测的结果

3．3．11 样品检测结果

3．4 讨论与分析

3．4．1 间接ELISA条件的优化

3．4．2 间接ELISA方法的特点

3．5 小结

第4章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历