牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其E0核酸疫苗与细胞因子佐剂联合免疫研究

摘要

牛病毒腹泻/粘膜病病毒(BVDV/MD)是黄病毒科瘟病毒属的成员，给世界养牛业造成了巨大经济损失。目前，国内还没有商品化疫苗，急需研制出新型理想的疫苗防制该病。BVDV的结构蛋白E0保守性高，具有中和表位。本研究针对新疆地方分离株BVDV-TC的E0基因及两种细胞因子GM-CSF、IL-2构建重组真核表达质粒，研究核酸疫苗与细胞因子佐剂联合免疫的效果。
　　本研究分离出牛病毒性腹泻新疆株并命名为BVDV-TC，利用RT-PCR分别扩增出BVDV-TC的E0及牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因片段，插入到pVAX1载体，构建真核表达质粒。然后利用脂质体2000将各重组质粒转染至BHK-21细胞进行瞬时表达，RT-PCR和Western blot实验分析显示，E0基因的真核重组表达质粒都成功转染至BHK-21细胞，并进行了表达;MTT实验表明细胞因子GM-CSF重组质粒转染组细胞的培养物可刺激淋巴细胞增殖，具有良好的生物学活性。
　　健康小鼠分组并免疫接种重组质粒:仅注射pVAX1-E0、pVAX1-E0分别与实验室以构建好的pVAX1-IL-2; pVAX1-GM-CSF; pVAX1-GM-CSF和pVAX1-IL-2共同免疫小鼠，并将空载体pVAX1作为对照组。通过间接ELISA及MTT检测免疫小鼠血清中特异性E0抗体及脾淋巴细胞的增殖水平，与对照组相比，接种真核重组质粒的小鼠E0抗体水平及淋巴细胞增殖水平都有所提高(P＜0.01)。而pVAX1-IL-2和pVAX1-GM-CSF共同免疫组则表现出更强的免疫刺激活性。
　　本研究成功构建了牛病毒性腹泻病毒E0核酸疫苗及细胞因子GM-CSF、IL-2佐剂，免疫后可以刺激产生细胞和体液免疫，且具有明显的免疫佐剂效应。该研究结果为牛病毒性腹泻的新型高效的核酸疫苗的研发提供了理论和实验数据。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第1章 引言

1．1 BVDV的生物学特性

1．2 BVDV的基因组和编码蛋白

1．3 主要临床症状

1．4 检测方法

1．5 BVD防控

1．6 提高DNA疫苗免疫效果的策略

1．7 研究的目的和意义

第2章 BVDV-TC株的分离鉴定

2．1 材料

2．2 样品鉴定

2．3 病毒分离培养

2．4 病毒分离鉴定

2．5 结果

2．6 讨论

第3章 BVDV-TC株E0真核表达载体的构建

3．1 材料

3．2 实验方法

3．3 结果

3．4 讨论

第4章 牛GM-CSF基因的克隆和生物学活性的鉴定

4．1 材料

4．2 实验方法

4．3 结果

4．4 讨论

第5章 核酸疫苗pVAX1-E0与细胞因子联合免疫效果研究

5．1 材料和试剂

5．2 实验方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

第6章 结论

参考文献

致谢

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