牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原捕获ELISA检测试剂盒的标准化研究

摘要

本文通过MDBK细胞增殖BVDV，收获病毒细胞培养物，利用PEG法和蔗糖密度梯度离心法，浓缩、纯化病毒，得到纯度较高的病毒。用纯化BVDV接种家兔的方法扩增病毒，结果表明，家兔接毒后，不产生定型热，且病毒毒力减弱。 用纯化BVDV分别免疫家兔和蛋鸡，制备出琼扩效价为1：32以上的兔抗BVDV高免血清与ELISA效价为1：6400的抗BVDV卵黄抗体，并分别得出这两种抗体消长的规律。复苏本实验室研制并保存的8株分泌抗BVDV单抗隆抗体杂交瘤细胞株，按常规方法制备单抗腹水。经间接ELISA检测，结果除一株(5F11)杂交瘤细胞株抗体滴度下降明显外，其余7株无明显变化，均能稳定分泌抗体。 通过对抗原捕获ELISA反应条件的优化，确定了各组分的最佳工作条件，并在此基础上组装成两套检测试剂盒。通过试验确定，BBI公司生产的酶标板(变异系数为4.3％)为试剂盒所用酶标板；兔抗BVDV高免血清、抗BVDV卵黄抗体最佳包被浓度分别为1：1000和1：50；待测血清样品稀释浓度为1：20；McAb最适稀释浓度为1：10，HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1：800。组装成了两套试剂盒，经试验，两套检测试剂盒的检测灵敏度均达到274ng/mL，其敏感性是AGP的100倍，与AGP阳性符合率是100％；与冠状病毒及轮状病毒无交叉反应，但与猪瘟病毒存在交叉反应；通过引入质控血清进行质控检验，两种检测试剂盒所得检测结果均在质量控制范围内，达到预定标准化要求。经稳定性、重复性试验，试剂盒①批间和批内的变异系数分别为8.37％和4.31％；试剂盒②批间和批内的变异系数分别为8.94％和4.75％。试剂盒保存于4℃1个月，仍能保持检测结果稳定。 试验结果表明：标准化的抗原捕获ELISA试剂盒具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点，可广泛应用推广，为我国BVDV监测提供了行之有效的技术手段，为试剂盒的商品化奠定了基础。

目录

文摘

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第一章 文献综述

第二章 实验研究实验一抗原的制备

第二章 实验研究试验二 抗BVDV卵黄抗体和兔抗BVDV高免血清的制备

第二章 实验研究试验三 单抗腹水的制备

第二章 实验研究实验四 抗原捕获ELISA检测试剂盒的标准化

第三章 结论

参考文献

附录主要溶液配制

致谢

研究资助

作者简介

石河子大学硕士研究导生学位论文导师评阅表