甜瓜细菌性果斑病菌菌株哈17A致病相关基因lysR的克隆

摘要

甜瓜细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch of Melon简称BFBM)是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenae SUbsp．citrulli Willems et al，1992)引起的一种病害，可以严重危害西、甜瓜的叶片和果实，造成西瓜和甜瓜的大量减产，是国际规定的检疫性植物病害之一。目前，对该病原菌致病机制的研究鲜有报道。本研究从遗传学角度初步研究了该病原微生物的致病相关基因，为进一步研究该病菌和宿主之间的互作提供了材料。 哈17A菌株为甜瓜的致病菌株，分离自新疆罹病甜瓜叶片。本研究运用16SrDNA序列同源性分析、特异性引物PCR和全细胞脂肪酸分析的方法，将菌株哈17A鉴定为A．avenae subsp．citrulli，同时对其部分生物学特性也进行了初步分析。 本研究利用三亲杂交的方法将带有抗卡那标记的Tn5转座子转入甜瓜果斑病菌哈17A的细胞中，转座子随机插入到哈17A基因组DNA上，获得突变体库。利用“叶片离体筛选法”筛选致病性减弱的突变体，从2000多个突变体中筛选到得到致病性明显减弱的突变体5个。其中，通过“鸟枪法”成功克隆到突变体W-46的Tn5例翼序列。根据测序结果BLAST比对得知，该基因的产物与A．avenae subsp．citrulli AAC00-1中LysR家族的转录调控蛋白(LTTR)LysR的相似性达到100％，我们命名该基因为lysR。根据测序结果设计引物，扩增包含目标基因的一段序列，构建互补载体，对突变菌株W-46进行功能互补，得到了致病力恢复的互补菌株C-46，证明lysR基因与菌株哈17A的致病性密切相关。另外，lusR与哈17A菌株中其他致病性相关基因的关系有待进一步验证。 本研究从传统的植物病理学入手，建立了筛选燕麦嗜酸菌致病菌株哈17A突变体的筛选体系--离体叶片筛选法，优化了研究燕麦嗜酸菌西瓜亚种致病性的遗传学实验方法，为燕麦嗜酸菌西瓜亚种的致病性分子遗传机制的研究提供了研究基础，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

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论文说明：缩略词

声明

第一章文献综述

1.1细菌性果斑病研究进展

1.1.1寄主范围与分布

1.1.2危害与症状特点

1.1.3传播及侵染循环

1.1.4病原菌形态与生物学特性

1.1.5防治

1.1.6西瓜果斑病菌的检测和鉴定技术

1.2植物病原细菌与致病过程有关的基因

1.2.1与病原细菌侵染有关的基因

1.2.2决定显性的基因

1.2.3决定寄主范围的基因

1.2.4决定致病性的基因

1.2.5质粒及其在致病中的作用

1.2.6植物病原细菌致病基因的调控机制

1.3 LysR家族转录因子和其作用

1.3.1LysR家族转录因子的基本特征和主要功能

1.3.2调节细菌和真核生物相互作用的LysR家族转录因子

1.4研究目的和意义

第二章甜瓜致病菌株哈17A的鉴定及部分生物学特性分析

2.1材料与方法

2.1.1供试菌株

2.1.2培养基

2.1.3 DNA操作与序列分析

2.1.4 16S rDNA的克隆

2.1.5特异性引物PCR

2.1.6脂肪酸分析

2.2部分生物学特性分析

2.2.1菌株生长与温度的关系

2.2.2碳素化合物的利用

2.2.3抗生素敏感性测定

2.3结果与分析

2.3.1哈17A菌株的鉴定结果

2.3.2温度对病原菌生长的测定结果

2.3.3哈17A对碳源的利用结果

2.3.4对抗生素敏感性测定结果分析

2.3结论

2.3.1哈17A的鉴定

2.3.2哈17A菌株部分生物学特性的分析

第三章致病相关基因的筛选

3.1材料与方法

3.1.1供试菌株及植物材料

3.1.2培养基与常用缓冲液

3.1.3 DNA操作

3.1.4 Tn5突变及突变子的筛选

3.1.5突变子的检查

3.1.6生长曲线测定方法

3.2结果与分析

3.2.1突变子的筛选结果

3.2.2嗜酸菌野生菌株哈17A及其突变菌株W-46生长曲线的测定

3.3讨论

第四章基因克隆、分析与互补功能验证

4.1材料与方法

4.1.1供试菌株及质粒

4.1.2培养基和植物材料

4.1.3基因操作

4.1.4致病相关基因的克隆

4.1.5互补载体的构建

4.1.6互补菌株生物测定

4.2结果与分析

4.2.1 Mini-Tn5转座子侧翼序列的获得

4.2.2 Mini-Tn5转座子侧翼序列测序结果与分析

4.2.3 PCR扩增目的片段

4.2.4野生lysR基因的克隆，测序

4.2.5 lysR氨基酸序列比对结果及分析

4.2.6互补载体的构建

5.2.2互补菌株生物测定结果

4.2.7lysR序列的分析

4.3讨论

第五章结论与讨论

5.1主要结论

5.2讨论

参考文献

致谢

作者简介

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