K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶与复活因子的克隆表达及其复活关系研究

摘要

以自主筛选的产1,3-丙二醇菌株为基础，研究了甘油脱水酶的催化反应特性，通过克隆和表达甘油脱水酶与复活因子，定量研究了复活因子和其它因素与失活甘油脱水酶的复活关系。通过研究得剑以下结果： 从新疆特殊环境土壤中筛选到在厌氧条件下能够转化甘油生成1,3-丙二醇的菌株XJPDLi-2，经鉴定后命名为K. pneumoniae XJPD-Li(缩写 XJPD-Li)。摇瓶发酵实验确定其最佳发酵条件为：温度40℃，pH8.0，硫酸铵6.0g/L，底物甘油20g/L利葡萄糖2.5 g/L。5L发酵罐批式发酵表明该菌在8h内可消耗20g/L甘油，1,3-丙二醇浓度达12.2 g/L，甘油的摩尔转化率达理论值0.75。补料批式发酵发现48h可消耗66.4g/L甘油合成38.1g/L的1,3-丙二醇，转化率达0.70，表明XJPD-Li菌是具高转化率的1,3-丙二醇生产菌株。 以XJPD-Li菌甘油脱水酶为酶源研究了其酶促反应特性。结果表明该酶的表达合成与菌体生长呈现明显的耦合关系。催化反应的最适温度为40℃，且在40℃以下酶的稳定性较好。最适pH值为8.0，在6.0～8.0之间甘油脱水酶活性较高，稳定性也好。Na<'+>、Mg<'2+>、Mn<'2+>和Fe<'2+>对甘油脱水酶催化反应具有一定促进作用，而Ca<'2+>、Co<'2+>、Fe<'3+>、Zn<'2+>和Cu<'2+>对其活性均有抑制作用。该酶分别以甘油和1,2-丙二醇为底物时最高反应浓度分别为0.15mol·L<'-1>和0.3mol·L<'-1>左右，动力学常数K<,m>分别为5.57mmol·L<'-1>和8.16mmol·L<'-1>。研究也表明该酶催化反应的活化能E<,a>为18.904kJ·mol<'-1>。 利用PCR方法从XJPD-Li基因组DNA中分别克隆山甘油脱水酶基冈dhaBCE和甘油脱水酶复活因子基闪dhaFG片段。分别构建表达载体PET-28a(+)-dhaBCE利PET-28a(+)-dhaFG后转化E.coli BL21(DE3)，在25℃、OD<,600>为0.6时用0.4mMIPTG诱导后均成功表达出具有生物活性的目标蛋白，诱导5小时后重组菌中甘油脱水酶活力达299U·mg<'-1>，约为原始菌的300倍。重组菌中复活因子可使甘油和氧失活的脱水酶活力均恢复90％以上。 重组菌中甘油脱水酶在以甘油为底物催化反应时，3min酶活就损火约35％，1h后活性仅剩2.7％；通氧时其活性损失更快，3min损失48％，1h后仅剩1.5％。通过定量研究甘油失活脱水酶的复活效果确定其最佳的复活条件为：ATP 50mmol·L<'-1>、Mg<'2+>10mmol·L<'-1>、辅酶B<,12>3 μmol·L<'-1>、甘油脱水酶与复活因子的质量比4：1，在此条件下甘油和氧失活脱水酶的活力可分别恢复98.9％和97.3％。各因子对甘油脱水酶的复活贡献程度研究表明，脱水酶与复活因子质量比和ATP对脱水酶有效复活的贡献程度最大，但四种因子均是甘油脱水酶复活的必需因子。复活动力学研究表明在ATP、Mg2’和辅酶B12存在情况。卜，复活冈子均能快速复活甘油和氧火活的脱水酶，且反应前10min复活速率较大，甘油失活脱水酶更易复活，复活反应60min后丙醛的积累量是氧失活脱水酶复活后的1.5倍。 通过基因工程手段获得甘油脱水酶并进行催化失活与复活关系研究，将为构建新的甘油脱水酶体外催化与复活体系提供依据，也为 1,3-丙二醇的生物合成调控提供理论指导，对促进生物法合成1,3-丙二醇的工业化进程具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1 1，3-丙二醇概述

1.1.1 1，3-丙二醇的基本性质

1.1.2 1，3-丙二醇的主要用途

1.1.3 1，3-丙二醇的生产概况

1.2生物法合成1，3-丙二醇的研究进展

1.2.1生物合成1，3-丙二醇的菌种和生产能力

1.2.2生物合成1，3-丙二醇的代谢途径

1.2.3生物合成1，3-丙二醇的基因工程生产情况

1.3生物合成1，3-丙二醇关键酶—甘油脱水酶的研究进展

1.3.1甘油脱水酶的结构和性质

1.3.2甘油脱水酶的催化机理

1.3.3甘油脱水酶的失活研究情况

1.3.4甘油脱水酶的克隆表达研究情况

1.4甘油脱水酶复活因子的研究进展

1.4.1甘油脱水酶复活因子的结构与性质

1.4.2甘油脱水酶复活因子的复活机理

1.4.3甘油脱水酶复活因子的克隆表达研究情况

1.5论文的研究意义和技术框架

1.5.1论文研究的意义

1.5.2技术路线

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1土壤样品来源

2.1.2菌种和质粒

2.1.3培养基

2.1.4实验仪器

2.1.5实验试剂

2.2实验方法

2.2.1产1，3-丙二醇菌种的筛选方法

2.2.2菌株鉴定方法

2.2.3主要基因操作方法

2.2.4蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.3分析方法

2.3.1菌体生物量的测定

2.3.2代谢产物的高效液相色谱分析

2.3.3蛋白质浓度的测定

2.3.4丙醛浓度的测定

2.3.5甘油脱水酶活性的测定

2.3.6甘油脱水酶复活因子活性的测定

第三章产1，3-丙二醇菌株的筛选、鉴定和发酵特性

3.1 1，3-丙二醇产生菌株的筛选

3.1.1菌株筛选方法的建立

3.1.2目标菌株的筛选

3.2 1，3-丙二醇产生菌株的鉴定

3.2.1菌株形态观察

3.2.2 16SrDNA核酸特征分析

3.2.3菌株生理生化特征分析

3.3 K.pneumoniae XJPD-Li菌发酵特性

3.3.1 K.pneumoniae XJPD-Li菌生长与产物形成关系

3.3.2培养温度对菌体生长和1，3-PD合成的影响

3.3.3初始pH对菌体生长和1，3-PD合成的影响

3.3.4氮源对菌体生长和1，3-PD合成的影响

3.3.5初始甘油浓度对菌体生长和1，3-PD合成的影响

3.3.6辅助碳源对菌的生长和1，3-PD合成的影响

3.4 K.pneumoniae XJPD-Li批式和补料批式发酵研究

3.4.1 K.pneumoniae XJPD-Li批式发酵

3.4.2 K.pneumoniae XJPD-Li补料批式发酵

小结

第四章K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶的催化反应特性

4.1甘油脱水酶活性与菌体生长关系

4.2温度对甘油脱水酶活性的影响

4.2.1最适反应温度

4.2.2热稳定性

4.3 pH对甘油脱水酶活性的影响

4.3.1最适反应pH

4.3.2 pH稳定性

4.4金属离子对甘油脱水酶活性的影响

4.5底物浓度对甘油脱水酶活性的影响

4.5.1甘油对甘油脱水酶活性的影响及动力学参数

4.5.2 1，2-丙二醇对甘油脱水酶活性的影响及动力学参数

小结

第五章K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶的克隆与表达

5.1甘油脱水酶基因的克隆、鉴定和序列分析

5.1.1甘油脱水酶dhaBCE基因的扩增

5.1.2甘油脱水酶dhaBCE基因的克隆与鉴定

5.2甘油脱水酶表达质粒PET-28a(+)-dhaBCE的构建

5.3重组质粒PET-28a(+)-dhaBCE在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达

小结

第六章K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶复活因子的克隆与表达

6.1甘油脱水酶复活因子α亚基基因的克隆、鉴定和序列分析

6.1.1甘油脱水酶复活因子α亚基dhaF基因的扩增

6.1.2甘油脱水酶复活因子α亚基dhaF基因的克隆与鉴定

6.2甘油脱水酶复活因子β亚基基因的克隆、鉴定和序列分析

6.2.1甘油脱水酶复活因子β亚基dhaG基因的扩增

6.2.2甘油脱水酶复活因子β亚基dhaG基因的克隆与鉴定

6.3甘油脱水酶复活因子表达质粒PET-28a(+)-dhaFG的构建

6.4重组质粒PET-28a(+)-dhaFG在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达

小结

第七章甘油脱水酶的催化失活与复活动力学

7.1甘油脱水酶的催化失活动力学

7.2定量研究失活甘油脱水酶的复活效果

7.2.1辅酶B12对失活甘油脱水酶复活的影响

7.2.2 ATP对失活甘油脱水酶复活的影响

7.2.3 Mg2+对失活甘油脱水酶复活的影响

7.2.4甘油脱水酶与复活因子质量比对失活甘油脱水酶复活的影响

7.2.5正交实验优化各因素对失活甘油脱水酶的复活效果

7.3各因素对失活甘油脱水酶复活的贡献程度

7.4甘油脱水酶的复活动力学

小结

第八章结论与展望

8.1结论

8.2展望

参考文献

附录

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表