犬细小病毒（CPV）的分离鉴定及其卵黄抗体（IgY）治疗制剂的研制

摘要

犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)是一种引起犬出血性肠炎或心肌炎的单链线状DNA病毒。据石河子兽医防疫部门统计,在当地犬的各种传染病中,犬细小病毒性肠炎发病率、死亡率均为最高,为犬的主要传染病之一。目前该病还没有有效的治疗药物,开发CPV抗体及其诊断、治疗试剂将有助于该病的防治。 本研究从临床疑似犬细小病毒感染病死犬的内脏中分离CPV,应用F81猫胎肾传代细胞增毒,Sepharose-4B层析与Fractogel* EMD TMAE(M)强阴离子交换层析相结合的方法纯化病毒,对分离病毒用常规方法血凝及血凝抑制、免疫电镜和PCR法予以确认。继而以纯化的CPV作为抗原免疫健康产蛋鸡,收集鸡蛋,用改良PEG6000法和水稀释法提取卵黄抗体(IgY)。用琼脂扩散法和间接ELISA法测定IgY效价以及体外中和病毒效价。在动物实验中,以纯化的CPV毒株实验室人工攻毒感染2～3月龄幼犬5只,待出现明显临床症状时,用特异卵黄抗体进行治疗,考察其疗效。进而在石河子兽医门诊临床治疗发病犬,从较大样本中统计治愈率。 研究结果显示,分离CPV的接种F81细胞产生明显细胞病变,凝集猪红细胞效价达29,并能被犬细小病毒阳性血清所抑制；免疫电镜观察外观呈圆形、直径约20～24nm病毒粒子；根据犬细小病毒的基因组设计特异引物进行PCR扩增,得到犬细小病毒VP2基因组全长,提交GenBank(EU170352),经序列分析,确定分离毒株为CPV-2a型。暂命名为CPV-SHZ株。改良PEG6000法提取IgY的蛋白浓度高,而水提法IgY纯度高。琼脂扩散法与间接ELISA法测定IgY最后一次免疫后10天的效价分别为1:32和1:24000。实验室小规模动物实验和较大规模临床实验分别获得100％和79.4％的治愈率和明显的动物保护效果。 本研究在新疆石河子地区成功分离到犬细小病毒CPV-SHZ株,为我国该病流行病学提供一定的参考资料,并且针对该病原体制备了高效价的IgY抗体,应用抗体的中和特性,临床治疗效果显著。所得抗体经济、方便、可大规模生产,研究结果显示,CPV卵黄抗体可进一步开发为抗体制荆,用于该病的预防和治疗。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

声明

第一章文献综述

文献综述(一)犬细小病毒的研究进展

文献综述(二)IgY技术研究进展

第二章试验研究

试验一犬细小病毒的分离与纯化

1材料与方法

2细胞培养、病毒增殖与提纯

3结果

4讨论

试验二犬细小病毒的鉴定

1材料

2方法

3结果

4讨论

试验三抗CPV卵黄抗体的制备

1材料与方法

2 IgY的制备

3结果

4讨论

试验四动物试验

1材料

2方法

3结果

4讨论

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介