蓝紫色矮牵牛色素基因F3’5’H和DFR的克隆与植物转化

摘要

目的：自然界中的花色种类繁多,但是一些重要花卉都缺少蓝色花品种,所以花色改良的研究工作-直是育种工作的重要目标之一。在花色素苷代谢途径中,类黄酮3'5'羟基化酶F3'5'H是形成蓝色花最关键的酶,能使花色素的合成趋向于蓝色的飞燕草色素；二氢黄酮醇-4-还原酶DFR能特异地催化二氢黄酮醇还原成无色的花色素,对花色素苷的最终形成起决定性作用。F3'5'H基因作为蓝色基因的重要组成部分之一,研究F3'5'H基因的表达可为今后利用基因工程技术改良花色研究奠定基础。 方法：本实验从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术进行F3'5'H cDNA片段和DFR cDNA片段的克隆。分别将F3'5'H基因和DFR基因连接到含有35S启动子的植物表达载体pBI-121上,成功构建植物表载体pBI-F3'5'H及pBI-DFR,并用农杆菌介导法对粉红色品系矮牵牛进行了F3'5'H基因的遗传转化。 结果：测序结果分析表明,克隆得到的F3'5'H基因的序列与NCBI登录的cDNA序列(D14588)相似性达到99.34％,开放读码框为1521bp,编码506个氨基酸。根据F3'5'H cDNA的测序结果推算氨基酸序列,并与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现推算的氨基酸序列与已报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6％。DFR基因的编码框长度为1143 bp,与NCBI登录的cDNA序列(X15537)相似性为99.39％,编码380个氨基酸。根据DFR cDNA的测序结果推算氨基酸序列,与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,推算的氨基酸序列与已报道序列相似性达到100％。 实验利用转基因技术将F3'5'H基因转化到粉红矮牵牛中,通过对转化植株进行PCR及RT-PCR鉴定,确定已获得转基因植株,下一步将在此基础上进一步研究F3'5'H基因对花色的影响,以期得到花色变异植株。 结论：本论文已从矮牵牛中成功克隆了花色素苷代谢途径中编码两个关键性酶的F3'5'H和DFR基因,构建了植物表达载体pBI-F3'5'H,建立了粉红色品系矮牵牛的再生系统,初步获得了转基因矮牵牛植株,为进一步利用基因工程技术改良植物花色奠定了基础。

目录

文摘

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引言

第一章文献综述

1.1花色基因工程研究概况

1.1.1花色与色素分类

1.1.2花色与色素的组成关系

1.2蓝色基因简介

1.2.1蓝色花的相关色素及生成条件

1.2.2蓝色基因F3'5'H

1.3蓝色基因工程研究现状

1.3.1 利用基因工程改变花色的途径

1.3.2 F3'5'H基因的研究现状

1.4存在的问题及展望

1.4.1影响花色的其他因素

1.4.2蓝色基因工程的不足

1.5本研究的目的与意义

第二章F3'5'H与DFR基因的克隆及植物表达载体的构建

2.1实验材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2酶与试剂盒

2.1.3植物材料

2.1.4主要仪器设备

2.1.5细菌培养基

2.1.6分子生物学常用生化试剂

2.2方法

2.2.1引物的设计

2.2.2扩增目的基因片段

2.2.3 目的基因的连接、转化与测序

2.2.4植物表达载体的构建

2.2.5农杆菌工程菌的构建

2.3结果与分析

2.3.1.矮牵牛F3'5'H与DFR基因的获得

2.3.2 pGM-T Easy连接产物的酶切鉴定

2.3.3植物表达载体pBI-F3'5'H及pBI-DFR的构建

2.3.4 F3'5'H基因序列与结构的分析

2.3.5 DFR基因序列与结构的分析

2.4讨论

第三章植物的遗传转化及检测

3.1实验材料

3.2方法

3.2.1植物培养基

3.2.2根癌农杆菌介导的矮牵牛的转化和再生

3.2.3转基因矮牵牛的检测

3.3结果与分析

3.3.1矮牵牛再生体系的建立

3.3.2农杆菌侵染矮牵牛及转基因植株的获得

3.3.3转基因矮牵牛的检测

第四章讨论与结论

4.1讨论

4.1.1矮牵牛再生体系的建立

4.1.2农杆菌介导的目的F3'5'H基因的转化

4.1.3转基因矮牵牛的检测

4.2结论

参考文献

附 录

致 谢

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