硫化氢供体对实验性肝硬化大鼠门静脉压力的影响及其相关酶学研究

摘要

目的：
　　 本课题将复制硫化氢(H2S)过载的正常和肝硬化大鼠模型，分别在NO、CO抑制及不抑制两种状态下，观察H2S含量过载对肝硬化大鼠门静脉压力的影响及其相关酶学的变化，以探讨内源性H2S在肝硬化门静脉高压中的作用，进一步研究肝硬化发生发展的机制，为肝硬化门静脉高压的临床治疗提供理论基础。
　　 材料和方法：
　　 1.动物分组、肝硬化模型复制及干预剂实施：将72只雌性SD大鼠随机分为肝硬化模型组（40只），正常组（32只）；肝硬化模型组大鼠皮下注射40％四氯化碳棉籽油溶液,首剂0.5ml/100g，后每隔4天注射一次，每次0.3ml/100g，共注射12次，15％乙醇溶液作为唯一饮用液体，并给予高脂高胆固醇饲料。根据预实验肝硬化形成经验（第一次注射起实验第52天形成肝硬化模型）；正常组大鼠同期皮下注射生理盐水，剂量同实验组，采用标准饲料喂养。造模结束后正常组大鼠随机分为4组：正常非抑制（NF）组,正常抑制（NC）组，过载H2S正常非抑制（SF）组和过载H2S正常抑制（SC）组，每组8只；肝硬化模型组随机分为4组：肝硬化非抑制（HF）组，肝硬化抑制（HC）组，过载H2S肝硬化非抑制（SHF）组和过载H2S肝硬化抑制（SHC）组，每组8只；给予过载H2S组大鼠供体硫氢化钠（NaHS）56umol/kg.d-1腹腔注射，NO、CO抑制组大鼠腹腔注射L-NAME: 5mg·kg-1·d-1和ZnPP: 20umol·kg-1·d-1颈部皮下注射,总时间为一周。
　　 2.结果观察：干预结束后，10％水合氯醛麻醉大鼠，应用静脉穿刺针接多导压力换能器测量门静脉压力；测定门静脉血浆中H2S、NO、CO含量；HE染色观察肝脏病理学变化；应用免疫组化法观察肝门区门静脉血管内皮细胞和平滑肌细胞中CSE、HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达，并用计算机图文分析系统半定量检测其蛋白表达强弱，灰阶值越低说明表达越强；采用Westblot技术检测肝组织中CSE、HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达，用凝胶成像系统对曝光后条带的灰度值进行分析,同时用β-actin校正加样量。实验数据用SPSS16.0统计软件进行分析，作单因素方差分析，用LSD法对多个样本均数进行比较，P<0.05示差异具有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.肝硬化大鼠模型复制
　　 通过病理学观察，模型组大鼠肝脏均达到肝纤维化IV级或V级病理阶段，造模过程中大鼠死亡率在正常范围（<20％）。
　　 2.大鼠门静脉压力变化
　　 与NF组相比，HF、HC、SHF和SHC组门静脉压力明显升高（p均<0.01）；与HF相比，HC、SHF组压力均降低（p<均0.01）；SHC组压力低于HC组（p<0.01）；
　　 3.大鼠门静脉血浆中H2S、CO、NO含量变化
　　 与NF组相比，NC、SF、SC组血浆中H2S含量升高（p均<0.05），NO、CO含量均降低（p均<0.01），HF组血浆中H2S含量降低（p<0.01），NO、CO含量均升高（p均<0.01）；
　　 与HF组相比，HC、SHF和SHC组血浆中H2S含量均升高（p均<0.01），NO、CO含量均降低（p均<0.01）；SHC组H2S含量高于HC组（p<0.01），NO、CO含量均低于HC组（p均<0.01）；
　　 4.肝门区门静脉血管及肝组织中CSE、HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达
　　 与NF组相比，NC、SF、SC组门静脉血管及肝组织中CSE蛋白表达均增强（p均<0.01），HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达均减弱（p均<0.01），HF组肝组织中CSE、eNOS蛋白表达减弱（p<0.01），HO-1、iNOS蛋白表达均增强（p均<0.01），门静脉管壁中CSE蛋白表达减弱（p<0.01），HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达均增强（p均<0.01）；
　　 与HF组相比，HC、SHF、SHC组门静脉血管及肝组织中CSE蛋白表达增强（p均<0.01），HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达均减弱（p均<0.01）；SHC组CSE蛋白表达强于HC组（p<0.01），HO-1、iNOS、eNOS蛋白表达均弱于HC组（p均<0.01）；
　　 结论：
　　 1.采用复合因素法制备大鼠肝硬化模型成功。
　　 2.H2S-CSE体系在肝硬化模型组中表达下调，而CO-HO-1及NO-NOS体系表达上调；
　　 3.给与NO/CO抑制剂后，大鼠CO-HO-1及NO-NOS体系表达下调，H2S-CSE体系上调，肝硬化门脉高压状态得以缓解，正常组大鼠门静脉压力无明显变化；
　　 4.给予H2S供体后，H2S-CSE体系上调，大鼠CO-HO-1及NO-NOS体系表达下调，肝硬化门脉高压状态得以缓解，正常组大鼠门静脉压力无明显变化；
　　 5.CSE-H2S体系与NOS-NO、HO-CO在肝硬化门脉高压及高动力循环中起着重要作用，可能具有相互负性调节作用。