E-钙粘素在大鼠阿霉素肾病动物模型中的表达及意义

摘要

目的：E-钙粘素(E-cadherin)是钙依赖性细胞间连接的细胞粘附分子之一，主要存在于人和动物的上皮细胞中，参与形成和维护正常细胞间的连接。其在肾内分泌的不平衡，可造成肾小球足细胞和基底膜连接的损害，使足细胞从肾小球基底膜上脱落。本研究建立大鼠阿霉素肾病（adriamycin-induced nephropathy ）模型，通过组织病理学观察、免疫组化和RT-PCR 方法，动态观察肾小球足细胞中E-cadherin的表达，探讨E-cadherin 变化在肾小球疾病中的作用及临床意义。
　　 方法：1.阿霉素肾病动物模型的建立：选取清洁级雄性SD 大鼠84 只，随机分为两组：
　　 对照组、阿霉素肾病组，肾病组大鼠经尾静脉一次性注射阿霉素注射液（浓度2mg/ml，7.5mg/kg 剂量），复制阿霉素肾病模型；正常对照组尾静脉一次性注射等体积的生理盐水。各组大鼠分别于建模后第1 周、2 周、3 周、4 周、6 周、8 周、12 周宰杀，每组各6 只，留取肾脏标本，处死前于大鼠内眦静脉采血约3ml，离心分离血清测血浆白蛋白、尿素氮、肌酐。大鼠处死前1天代谢笼收集24 小时尿液，测24 小时尿蛋白定量。2.电镜下观察足细胞形态改变，进行HE、Masson、PAS染色，光镜下观察肾脏病理改变情况。3.采用全自动生化分析仪测定血浆白蛋白，采用磺基水杨酸法测24 小时尿蛋白定量，分析各组间血浆白蛋白、24 小时尿蛋白的变化。4.用免疫组化技术检测E-cadherin、基质金属蛋白酶-9（MMP-9 ）和纤维连接蛋白（FN ）在阿霉素肾病模型肾小球内的表达，分析不同时间点各组间E-cadherin、MMP-9、FN 在肾小球内的表达情况，探讨其表达量与肾小球足细胞损伤程度之间的关系；5. RT-PCR 方法检测肾皮质内E-cadherin的mRNA的表达，从分子水平探讨E-cadherin与肾小球疾病的关系。
　　 结果：1.阿霉素肾病组大鼠前4 周均出现大量蛋白尿、低蛋白血症，第4 周电镜下可见肾小球足突广泛融合，与临床微小病变性肾病相似；第8 周部分肾小球发生局灶性硬化，与临床局灶节段性硬化相似；2.与对照组相比，肾病组24 小时尿蛋白定量从第1 周开始增加，随着时间的延长，尿蛋白有逐渐增加的趋势，同时肾病组血浆白蛋白从第1 周开始下降，呈时间依赖性递减，与对照组相比，差异均具有统计学意义（p<0.01 ）；前4周肾病组大鼠血尿素氮、肌酐无明显变化，第6 周末升高，随着实验周数的增加，升高更明显，呈现时间依赖性，12 周末达最大值，差异有统计学意义（p<0.05）；3.肾组织形态学与病理学改变：肾病组大鼠肾脏体积稍大，颜色深红，切面皮髓质分界也清楚，电镜可见肾小球足突融合或消失，有微绒毛的形成；光镜下显示：前2 周肾小球无改变，肾小管可见脂肪变性，随着病程进展，足细胞肿胀明显，并有小新月体形成及球囊壁纤维化，8 周时出现系膜细胞轻度增生，部分大鼠有肾小球毛细血管襻节段性硬化伴肾小管萎缩；随着病情进展病变加重；4.免疫组化：① E-cadherin的表达：与对照组相比，肾病模型组第3 周时E-cadherin 在肾小球内足细胞的表达开始下降，并随时间的延长，表达逐渐减少，12 周最低，差异有统计学意义（p<0.01 ）；② MMP-9的表达：MMP-9在肾小球的表达主要位于足细胞和内皮细胞，与对照组相比，肾病组第1 周末表达开始上调，第3 周末达高峰（p<0.01 ），后随时间的延长，表达逐渐减少，与对照组相比，差异有统计学意义（p<0.05 ）；③ FN的表达：在肾病组第1 周，FN的表达轻度上调，随着实验周数的增加，FN 在肾小球系膜区内的表达逐渐增加，12 周达高峰，与对照组相比，差异有统计学意义（p<0.01 ）；5. RT-PCR: 肾组织E-cadherin的mRNA 表达从第3 周开始减少，至第12 周降至正常组的1/5，与对照组相比，差异有统计学意义(p<0.01)；
　　 6. 相关分析结果显示：随着病变进展，E-cadherin 及其mRNA 在肾小球足细胞内的表达逐渐减少，FN 在肾小球系膜区的表达逐渐增加，MMP-9 在FSGS 阶段在肾小球足细胞和内皮细胞的表达逐渐减少，E-cadherin和FN 表达量之间呈高度负相关（r=-0.926，p<0.001 ），和MMP-9 在FSGS 阶段的表达量之间呈高度正相关（r=0.915，p<0.001 ）；
　　 MMP-9和FN 在FSGS 阶段的表达量之间呈高度负相关（r=-0.949，p<0.001 ），24 小时尿蛋白定量与E-cadherin、E-cadherin mRNA 之间呈负相关（r=-0.747/-0.742，p<0.01 ），与FN 表达量之间呈正相关（r=0.812，p<0.01 ）。
　　 结论：1.E-cadherin、E-cadherin的mRNA 在肾内表达的减少，与足细胞病变密切相关，它参与了足细胞病中肾脏损伤及肾小球硬化的病理过程，E-cadherin的表达减少可能是肾损伤早期预测指标之一；E-cadherin 从mRNA 水平参与了足细胞损伤的病理生理过程；
　　 2.E-cadherin与MMP-9 在阿霉素肾病FSGS 节段的表达呈高度正相关，与FN 在肾小球内的表达呈高度负相关，推测MMP-9和FN 也可能参与了阿霉素肾病足细胞损伤的病理过程；3.阿霉素肾病大鼠的蛋白尿量与E-cadherin、E-cadherin mRNA和FN 在肾小球内的表达呈一定相关性，其在肾组织中表达的高低对肾脏疾病预后的判断具有一定的意义。

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