用酵母双杂交技术筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白

摘要

催化DNA双链解开的酶是解螺旋酶，在几乎所有的核酸代谢过程（包括DNA复制、转录、重组、修复）中都有重要作用。DNA解螺旋酶的一级结构中存在一些高度保守的氨基酸序列，被称作解螺旋酶模序（helicasemotif）。
　　PIF1解螺旋酶家族是5'至3'解螺旋酶，在从酵母到人的进化中非常保守。在酵母中Pif1解螺旋酶的作用包括DNA修复、端粒长度的调节、DNA复制及遗传稳定性维持。人PIF1解螺旋酶功能所知甚少，在我们的前期研究中，通过生物信息学分析，发现PIF1家族蛋白在其解螺旋酶模序的上游—PIF1蛋白的N-末端在进化中也很保守，我们将其命名为PINT功能域(PIF1N-terminal，domain),我们研究还发现PINT功能域，具有使单链DNA退火形成双链的能力，且对整个解螺旋酶活性的调节具有重要作用。
　　本课题拟在已有工作的基础上，利用酵母双杂交（yeasttwo-hybridssystem）技术，寻找与PIF1相互作用的靶蛋白或上游信号分子，以期进一步明确人PIF1解螺旋酶在体内可能的生理功能。
　　我们分别用PIF1的PINT功能域（PIF1N）和PIF1的解螺旋酶模序（PIF1C）作为诱饵，用酵母双杂交系统分别筛选人HeLa文库，以寻找与各个功能域相互作用的蛋白。诱饵片段由聚合酶链式反应（PCR）扩增后连入酵母表达质粒pGB，测序检测pGB-Bait质粒，正确后转入酵母菌Y190。再用β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）显色实验检测诱饵蛋白是否有自激活，确定无自激活后将人Hela文库转入能够稳定表达诱饵蛋白的酵母菌株中，用缺陷平板（SD/-Leu-Trp-His+3AT）高强度筛选，将得到的阳性菌落扩增抽质粒。然后，将抽提的质粒与pGB-Bait共转化到Y190，进一步确认初筛为阳性的克隆。最后用生物信息学来分析筛选呈阳性克隆的文库质粒。
　　最终，以pGB-PIF1N为诱饵蛋白筛选人Hela文库，我们得到15个阳性克隆，对阳性克隆测序并对结果进行分析得到3条阳性基因：CCNDBP1、OTUD5、CAP1；以pGB-PIF1C为诱饵蛋白筛选人HeLa文库没有得到阳性克隆。
　　经过酵母双杂交实验我们成功地获得了PINT功能域的相互作用蛋白，为进一步研究PIF1在细胞凋亡和损伤修复方面的作用提供了一些新的线索。

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中文摘要

英文摘要

中英文缩略词对照表

前 言

1 Pif1解旋酶的历史和发展

2 人类Pif1的研究进展

材料与方法

1 材料

2 主要试剂及配制

3 主要仪器与设备

4 实验方法

5结 果

讨 论

结 论

参考文献

附录一 PIF1N目的基因序列

附录二 PIF1C目的基因序列

文献综述

致谢

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