布鲁氏菌病与结核病快速诊断技术的研究

摘要

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌侵入机体，进而引起传染变态反应性的人畜共患传染病。布鲁菌可感染人类、多种家畜和野生动物，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。因此对该病及时作出诊断有利于降低经济损失。为此，国内外学者相继建立了很多方法，但是这些方法或技术性强不适于基层使用，或价格昂贵，操作复杂，或结果不稳定。所以，建立敏感性高，特异性强，操作简便，便于基层推广使用的诊断方法是非常有必要的。本研究应用胶体金免疫层析法（GICA）研制一种布鲁氏菌病多联蛋白快速诊断试剂条，为布病的快速诊断提供了技术支持。
　　结核病是由结核分枝杆菌感染所导致的呼吸系统感染为主的人畜共患慢性传染病，对人畜健康损害严重。全世界目前约有三分之一的人感染该病。目前，结核病呈现出扩大趋势。但现有的用于诊断结核感染的方法都存在或多或少的缺陷，突出问题是灵敏度、特异性低。因此需要一种新的诊断技术以称补现有方法的不足。据此，根据相关文献报道，本实验建立了基质金属蛋白酶1和γ-干扰素体外释放试验，该法具有较高的敏感性和特异性，为结核病的早期诊断提供新的技术方法。现将主要研究成果报告如下：
　　1.布鲁菌外膜蛋白OMP31的表达、纯化：通过分子克隆技术对目的基因omp31进行扩增，然后将omp31目的基因连接到PMD18-T载体上，经过PCR、酶切和DNA测序鉴定正确后，构建pET-32a-omp31重组质粒，转化到DE3表达菌中进行经IPTG诱导表达，最后进行westernblot检测。SDS结果显示成功表达了omp31融合蛋白，并获得了高表达量和高纯度的蛋白，westernblot检测结果证明了omp31融合蛋白具有较高的免疫原性，为后续的免疫学检测奠定了试验基础。
　　2.检测布鲁氏菌多联蛋白试纸条的制备：用柠檬酸三钠还原剂制备胶体金溶液，在此基础上摸索胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白的最佳条件；并对其进行质量鉴定。用透射电镜和紫外/可见光谱仪（400nm-700nm）分析显示，制备的胶体金颗粒大小均一，约为20nm，适合免疫标记。胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白最pH为6.2，最适稳定浓度为6μg/ml。最佳抗原包被量为1μL/cm，人IgG的最佳包被浓度为2mg/ml。用研制的OMP31和BP26多联蛋白试纸条与仅有OMP31或BP26蛋白作为单一检测线的试纸条对15份布鲁氏菌标准阳性血清进行检测，多联蛋白试纸条阳检率为100％，与仅有OMP31或BP26蛋白作为单一检测线检测结果相同，与用琥红平板试验（RBPT）符合率为100%。检测其他血清结果显示该试纸条具有良好的特异性。试纸条可检出稀释125倍的羊布鲁氏菌标准阳性血清。本试纸条在4℃可保存6个月，表明该检测方法具有较高的稳定性。
　　3.建立肺结核IFN-γ和基质金属蛋白酶1体外释放试验诊断方法：分离提取结核病患者（结核组，20例）和健康人（健康对照组，20例）外周血淋巴细胞；用结核杆菌侵染12h后，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测培养上清液中MMP-1和IFN-γ浓度。结果显示结核组MMP-1与IFN-γ浓度明显高于健康对照组。检测时间为12小时左右。MMP-1与IFN-γ检测敏感度与特异度分别为（88.9%，100%）和（85.7%，100%）。肺结核的MMP-1体外释放反应对结核分枝杆菌感染的诊断结果与IFN-γ相一致，对结核病的临床诊断有辅助意义。本研究建立的肺结核基质金属蛋白酶1和IFN-γ体外释放试验诊断方法，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病，对活动性结核与其他疾病的鉴别很有意义，对牛结核病的诊断也有一定参考价值。

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引 言

第一章 文献综述

综述一 布鲁氏菌外膜蛋白及检测技术研究进展

1 布鲁氏菌外膜蛋白

2 布鲁氏菌诊断技术的研究进展

综述二 结核病诊断技术研究进展

1 γ-干扰素（IFN-γ）与基质金属蛋白酶1（MMP-1）

2 结核病检测技术

第二章 实验研究

试验一 布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的原核表达及纯化

1 材料与方法

2 结 果

3 讨论

试验二 检测布鲁氏菌抗体的胶体金免疫层析方法的建立

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

试验三 肺结核IFN-γ和基质金属蛋白酶1体外释放试验诊断方

1 材料与方法

2结果

3讨论

附：

参考文献

结论

创新点

致谢

作 者 简 介

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