Fat-1表达载体构建及转Fat-1基因萨福克羊成纤维细胞系的建立研究

摘要

目的:ω-3PUFAs对于维持生命有机体的正常发育和生长,防治各种疾病都有至关重要的作用,由于缺乏能够将ω-6PUFAs转化成ω-3PUFAs的脱氢酶基因,人体内的ω-6/ω-3PUFAs达不到1:1理想的平衡,所以每天必须摄入一定量的ω-3PUFAs,来保证有机体正常的功能和自身稳定。目前富含ω-3PUFAs食物主要是深海鱼类,来源范围很窄,导致人体内ω-6PUFAs过多而ω-3PUFAs严重不足,对婴幼儿智力发育、心脑血管疾病和癌症的预防起不了积极作用。因此从家畜繁殖与育种的角度出发,制备能够表达ω-3PUFAs的脱氢酶基因Fat-1的新品种绵羊,从而培育出富含ω-3PUFAs高品质羊肉。
　　方法:1.Fat-1表达载体构建及转基因细胞系建立
　　采用组织块附植法分离得到了18月龄萨福克公羊成纤维细胞系;通过PCR扩增得到了人泛素启动子UbB序列,对秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性进行优化,然后由公司合成获得oFat-1基因序列;双酶切法从pcDNA3.1中获得GBHpolyA序列,将上述3段序列共同插入pCMV-DsRed2-1载体的多克隆位点(MCS),得到重组真核表达载体pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,载体序列再经酶切和测序,结果与预期一致。用单酶切法将表达载体线性化后,采用脂质体包裹后转染绵羊成纤维细胞,经G418抗性和红色荧光标记筛选得到阳性细胞,并进行PCR和反转录PCR鉴定,HPLC检测细胞中不饱和脂肪酸的变化。
　　2.转基因绵羊的制备
　　将得到的转Fat-1的绵羊成纤维细胞作为核移植供体细胞,移入去核后的绵羊成熟卵母细胞内制备克隆胚,经过融合、激活、发育得到的2细胞期重构胚,移入同步处理的31只受体羊子宫内,6-7枚/羊,妊娠并产下羔羊后PCR初步检测外源基因,分别取三只羊耳部皮肤体外培养,进行细胞染色体数目分析。
　　结果:构建的真核表达载体序列正确,Fat-1基因能够在绵羊成纤维细胞基因组中正常表达,促进细胞ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化,ω-3PUFAs占总量的百分比从11.48％增加到24.41%,ω-6PUFAs的百分比从88.52%下降到75.59%,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值从7.82±0.18下降到3.10±0.03,差异极显著(P<0.01)。经过胚胎移植后有3只母羊妊娠,妊娠率9.67%,并顺利产下3只羔羊。经PCR初步检测有两只为转基因阳性,分别取三只羊耳部皮肤体外培养,进行细胞染色体数目分析,显示均具有正常的二倍体核型。
　　结论:成功构建了UbB启动子介导的Fat-1真核表达载体,筛选得到表达不饱和脂肪酸脱氢酶的绵羊细胞,实现人泛素启动子UbB调控外源基因Fat-1在绵羊细胞内表达,并经过核移植技术克隆得到了2只转基因羊,为进一步制备转基因克隆绵羊奠定了基础。

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文献综述

1Fat-1基因

2 不饱和脂肪酸脱氢酶的研究进展

3多不饱和脂肪酸

4 泛素启动子研究

5本课题研究的目的和意义

第2章 试验研究

试验1 萨福克羊成纤维细胞体外培养

1 材料和方法

2 试验结果与分析

3 讨论

4 小结

试验2 UbB启动子的功能验证

1 材料与方法

2试验结果

3 讨论

4.小结

试验3 含Fat-1基因表达载体的构建

1.试验材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4.小结

试验4Fat-1基因在绵羊成纤维细胞中的表达

1材料与方法

2 试验结果

3 讨论

4.小结

试验5 转Fat-1基因克隆绵羊的制备

1试验材料与方法

2 试验结果

3讨论

4 小结

全文结论

论文创新

参考文献

附录

致谢

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