中国美利奴绵羊PLCζ基因的克隆及表达研究

摘要

目的:中国美利奴绵羊是我国新疆特有的肉毛兼用绵羊品种之一,其屠宰加工量非常大。然而,卵巢组织的回收利用率并不高,核移植产生的克隆动物或转基因动物更是少之又少。目前多使用蛋白激酶抑制剂或蛋白质合成抑制剂来人工激活卵母细胞,其缺点是不能特异地抑制细胞周期中某种特定激酶的活性,或某个特定蛋白质的合成。这种方式可能影响卵母细胞的其他功能,或是对卵母细胞激活后的发育产生不利的影响,进而对卵母细胞激活后的发育可能产生有害的影响。因此,需要一种全新的卵母细胞激活制剂,它既不使用蛋白的合成抑制剂又不使用蛋白磷酸化抑制剂,并可通过单一增加Ca2+来激活卵母细胞。它的获得将能有效地提高优质囊胚的产出效率。本实验的目的在于探究磷脂酶Czeta(PLCζ)是否可以作为一种新的卵母细胞激活物质。
　　方法:(1)用TRIzol法提取了美利奴绵羊睾丸组织总RNA,通过反转录得到了cDNA,以cDNA为模板通过PCR扩增得到了PLCζ基因;
　　(2)经过T/A克隆将PLCζ基因与T载体连接,构建了克隆载体,然后通过双酶切,将PLCζ基因与原核表达载体pCzn1以及pEGFP-N1真核表达载体连接;
　　(3)pCzn1-PLCζ转入E.coli Arctic Express TM(DE3)表达菌中诱导表达;
　　(4)pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体经脂质体Lipofectamine TM 2000介导转到293T细胞中表达;
　　(5)用组织块法分离培养了美利奴绵羊胎儿成纤维细胞,通过脂质体Lipofectamine TM 2000转染将pEGFP-N1-PLCζ转入到绵羊胎儿成纤维细胞中表达;
　　(6)采集绵羊的卵巢后收集绵羊的卵母细胞,通过显微注射pEGFP-N1-PLCζ质粒,进行卵母细胞的孤雌激活。
　　结果:(1)成功克隆了美利奴绵羊的PLCζ基因,经测序与GenBank已公布的牛的PLCζ基因序列同源性最高;
　　(2)成功构建了PLCζ基因的原核表达载体(pCzn1-PLCζ),并获得融合蛋白;
　　(3)酶切与测序结果表明本实验成功构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体;
　　(4)pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体在293T细胞和绵羊胎儿成纤维细胞得到成功表达;
　　(5)将真核表达质粒注入卵母细胞可以激活绵羊卵母细胞的孤雌发育;
　　结论:(1)绵羊PLCζ基因能在体细胞系成功表达;
　　(2)PLCζ的重组质粒注入M期卵母细胞可促进卵母细胞的孤雌发育。

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前言

第一章文献综述

1 磷脂酶C的研究进展

2 受精中Ca2+释放机制的假说

3 卵母细胞的激活方法

4 PLCζ的特异之处

5研究目的及意义

第二章 实验内容

实验一 美利奴绵羊PLCζ基因的克隆及序列分析

1 材料和方法

2 结果

3讨论

4 小结

实验二 美利奴绵羊PLCζ基因的原核表达载体的构建与表达

1材料和方法

2结果

3 讨论

4 小结

实验三 美利奴绵羊PLCζ基因真核表达载体的构建及其表达研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

试验四 美利奴绵羊PLCζ基因在卵母细胞中表达的初步研究

1 材料和方法

2. 结果

3.讨论

4.小结

全文总结

创新点

参考文献

致谢

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