MHC不同基因型哈萨克绵羊人工感染细粒棘球绦虫虫卵后小肠、肝脏差异表达基因的筛选

摘要

细粒棘球蚴病,俗称包虫病,是细粒棘球绦虫的幼虫寄生于人、绵羊等中间宿主所致的一种人畜共患病。绵羊是细粒棘球绦虫最适宜的中间宿主,感染包虫病后生长发育缓慢,其毛、肉和奶的产量均严重受到影响,且患病绵羊肝、肺不能食用。最新调查显示,新疆存栏绵羊4000多万只,饲养数达6000多万只,而包虫病患病率达到50％,这给畜牧业的健康发展以及广大农牧民的生产创收带来严重影响。
　　本研究前期做了大量的关于绵羊主要组织相容性复合体基因(MHC基因)与包虫病抗性、易感性的相关研究,对新疆三个主要绵羊品种:中国美利奴羊、多浪羊及哈萨克羊MHC-DRB1基因外显子2进行PCR-RFLP检测,成功筛选出哈萨克绵羊与包虫病抗性相关的单倍型MHC-DRB1MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab,之后对带有该单倍型的绵羊(抗性组)和不带该单倍型的绵羊(非抗性组)进行人工攻虫,发现抗性组绵羊包虫病发病率比非抗性组绵羊低且差异显著。在此基础上,本文着重对前期筛选的具有包虫病抗性和非抗性的哈萨克绵羊的感染机制及其差异进行分析。
　　依据前期研究,本研究采用PCR-RFLP方法对250只哈萨克绵羊进行了相应抗性单倍型分析,共筛选出具有包虫病抗性的个体(基因单倍型为MHC-DRB1MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab)14只,非抗性个体(基因单倍型为MHC-DRB1MvaIbb-SacIIaa-Hin1Iaa)22只。进一步采用B超和ELISA结合的方法对筛选出的绵羊进行包虫病检测,随访后购买17只健康的绵羊,其中包括用于人工感染实验的绵羊14只(抗性组和非抗性组各7只),以及健康对照的绵羊3只。MHC抗性组绵羊记为A组,MHC非抗性组绵羊记为B组,健康对照的绵羊记为C组。人工感染实验的14只绵羊每只饲喂约5000个成熟细粒棘球绦虫虫卵,建立人工感染细粒棘球绦虫模型后,开展了以下后续试验:
　　1.实验一旨在检测不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫虫卵后早期机体免疫指标的差异。本实验分别于感染前(0d)、感染后2h、3h、4h、9h、1d、2d、3d、7d采集绵羊颈静脉血,采用ELISA方法检测血清中抗体(IgM、IgE)、细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10)及趋化因子(CXCL-9、CCL17)的水平,结果显示,MHC包虫病抗性组(A组)表现出以抗体IgE、IgM、Th1细胞因子(IFN-γ、TNF-α)和Th1趋化因子(CXCL-9)为优势的分泌水平,而非抗性组(B组)则表现出以Th2细胞因子(IL-4、IL-10)和Th2趋化因子(CCL17)为优势的分泌水平。且IgE、Th1细胞因子(IFN-γ、TNF-α)在虫卵感染后4h组间差异显著。提示,携带MHC抗性基因型的绵羊表现出强的包虫病抵抗力可能受其早期高水平的Th1细胞因子及IgE抗体的影响。
　　2.实验二旨在筛选出不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫后小肠组织差异表达的基因。本实验中,实验动物分为MHC包虫病抗性组(A)、MHC包虫病非抗性组(B)和健康对照组(C),A、B两组分别于感染后2h、3h、4h采集小肠组织,以C组健康绵羊作为健康对照组,采用基因芯片的方法分析不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫后小肠差异表达基因,其中感染组(A)、(B)与健康对照组(C)进行比较,结果发现:A与C之间差异表达的基因共4712个,其中表达量上调的有1959个,表达量下调的有2753个。B与C比较之后差异表达的基因4944个,其中2076个表达上调,2868个表达下调。从中选择出同C相比,A和B同为上调或下调,且表达量差异显著的基因共141个,其中上调的有32个基因,下调的有109个。上调的32个基因中,A组显著高于B组的有6个,低于B组的有26个;在下调的109个基因中,A组显著高于B组的35个,低于B组的74个。
　　3.实验三旨在筛选出不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫后不同时期(感染后8周、24周)肝脏组织差异表达基因。本实验中,实验动物分为MHC包虫病抗性组(A)、MHC包虫病非抗性组(B)和健康对照组(C),A、B两组分别于感染后8周、24周采集肝脏组织,以C组健康绵羊作为健康对照组,采用基因芯片的方法分析不同MHC基因型哈萨克绵羊感染细粒棘球绦虫后肝脏组织差异表达基因。
　　1)感染后8周,基因芯片结果显示:MHC抗性组(A)与对照组(C)之间差异表达的基因共3087个,其中表达量上调的有1768个,表达量下调的有1319个。MHC非抗性组(A)与对照组(C)比较之后差异表达的基因4839个,其中1888个表达上调,2951个表达下调。采用同样标准进一步筛选获得差异候选基因153个,其中上调的有87个基因,下调的有66个。上调的87个基因中,A组显著高于B组的有13个,低于B组的74个;在下调的66个基因中,A组显著高于B组的54个,低于B组的12个。
　　2)感染后24周,基因芯片结果显示:MHC抗性A组与C组之间差异表达的基因共3092个,其中表达量上调的有1374个,表达量下调的有1718个。MHC非抗性B组与对照C组比较之后差异表达的基因11717个,其中5381个表达上调,6336个表达下调。采用同样标准进一步筛选获得差异候选基因115个,其中上调的有40个基因,下调的有75个。上调的40个基因中,A组显著高于B组的有3个,低于B组的37个;在下调的75个基因中,A组显著高于B组的74个,低于B组的1个。对以上3组共8个样本的基因芯片结果进行荧光定量PCR检验,挑选8个基因进行验证,结果同芯片检测结果基本接近,说明检测结果真实可信。
　　3)对筛选到的差异表达基因进行GO富集和KEGG通路分析发现,差异基因主要的生化功能集中在代谢、细胞进程等方面,值得注意的是:KEGG分析结果显示参与补体凝集素途径的基因数量在小肠和肝脏24周结果中均为最多,同时在肝脏8周组中也相对较多,提示MHC同补体之间抵抗寄生虫感染可能存在关联。
　　4)结合相关文献报道和不同感染时期基因表达特点,本研究最终选择了杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR2DS1)、补体凝集素C8、丝氨酸蛋白酶抑制剂、生长抑制DNA损伤基因(GADD45B)、PLA2G2A等基因作为绵羊抵抗包虫病的候选基因。
　　综上所述得出如下结论:高水平的Th1细胞因子及IgE抗体能够影响绵羊对包虫病的早期抵抗,补体凝集素代谢通路可能在小肠和肝脏后期起到一定的抵抗作用。总体来说,参与抵抗包虫病的相关基因数量较多,涉及到能量代谢、免疫、信号转导等多个方面,说明包虫病抵抗是一个复杂的生理过程。同时,同非抗性组绵羊检测结果相比,在3个检测点上(小肠、肝脏8周、肝脏24周)MHC抗性组基因表现出基因表达不活跃的特点,具体表现为大部分基因上调或者下调幅度均低于非抗性组,但是一些可能同包虫病抵抗相关的基因仍表现出抗性组高于非抗性组的特点。

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缩 略 词 表

前言

第一篇 文献综述

第一章 家畜棘球蚴病(包虫病)概述

1. 病原学

2. 诊断

3. 流行病学

4.包虫病的防控现状

5. 小结与展望

第二章中间宿主感染包虫病的免疫应答研究进展

1. 宿主的先天性免疫

2. 宿主的后天免疫

第三章 基因芯片及其在寄生虫病上的研究应用

1. 基因芯片概述

2. 基因芯片在寄生虫病上的研究应用

3. 小结

第二篇 试验研究

第四章 哈萨克绵羊不同MHC基因型个体人工感染细粒棘球绦虫虫卵后早期机体免疫指标的差异分析

1. 材料与方法：

2. 实验结果与分析

3. 讨论

4. 小结

第五章 MHC不同基因型绵羊感染细粒棘球绦虫后小肠差异表达基因的筛选

1. 材料与方法

2. 结果与分析

第六章 MHC不同基因型绵羊感染细粒棘球绦虫虫卵后肝脏差异表达基因的筛选

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

全文结论及创新点

参考文献

附录

致谢

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