马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA应用研究

摘要

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata(Say)，又称科罗拉多甲虫或科罗拉多马铃薯叶甲，属于鞘翅目的叶甲科，是世界性检疫害虫之一。自20世纪90年代传入我国新疆地区以来，对我国的马铃薯生产构成了严重威胁。本试验通过测试表达马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA(dsSAHase)的大肠杆菌对马铃薯甲虫的干扰作用，研究储存条件对大肠杆菌菌液的影响，并初步探讨马铃薯甲虫体液对dsRNA的降解作用以及稳定剂的开发。研究结果对利用RNA干扰技术开发高效、专一性强、对人畜安全、对环境无污染的新型杀虫剂具有一定意义。本研究主要内容包括：
　　⑴dsSAHase对马铃薯甲虫 RNA干扰效应试验结果：通过饲喂法将不同剂量dsSAHase导入马铃薯甲虫体内，运用线性回归方法测算各龄期 LC50；同时观测饲喂后成虫的产卵数，解剖观察雌成虫卵巢发育情况。dsSAHase对马铃薯甲虫各龄期幼虫的的LC50分别为：1龄2.341μg/ml，2龄2.552μg/ml，3龄3.450μg/ml，4龄4.968μg/ml。饲喂dsSAHase后，马铃薯甲虫成虫表现为产卵极少或不产卵，其雌成虫卵巢发育等级与产卵情况正相关。dsSAHase对马铃薯甲虫幼虫具有显著致死作用、拒食作用以及抑制生长发育作用，各龄期幼虫的毒力随龄期增长而降低，对马铃薯甲虫成虫的繁殖能力具有显著的抑制效果。
　　⑵不同储存条件对 dsSAHase生物活性的影响研究结果：将用超纯水悬浮的表达dsSAHase的大肠杆菌E.coil菌体，分为灭活与不灭活两个处理，分别于-20℃、4℃、室温、37℃储存24h、48h、72h，将未脱培养基的表达 dsSAHase的大肠杆菌发酵液不灭活，在-20℃和室温条件下储存24h、48h、72h；将各处理大肠杆菌饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫，检测各因素对其活性的影响，明确其储存条件。大肠杆菌脱培养基后低温储存24h后生物活性优于新鲜菌，高温储存24h后仍有较高活性，储存48h后效果减弱；大肠杆菌是否脱培养基在低温下储存对 dsRNA活性影响不大，高温下储存影响较大；大肠杆菌脱培养基后储存则温度、是否灭活对活性影响不大。dsRNA大肠杆菌菌体在-20℃、4℃、室温、37℃条件下可以在24h内储存。
　　⑶马铃薯甲虫体液对dsRNA的降解作用及聚乙烯亚胺（PEI）对dsRNA的保护作用试验结果：马铃薯甲虫中肠液及淋巴液与dsSAHase在不同温度条件下体外孵育，观测其作用结果；构建聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)PEI-dsSAHase复合物，饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫，观测PEI对dsSAHase的增效作用。马铃薯甲虫中肠液与淋巴液都降解dsSAHase，该降解作用受温度影响较小。单体dsSAHase菌液饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率为55％，而PEI-dsSAHase复合物饲喂马铃薯甲虫2龄幼虫死亡率达到75%。dsRNA会被马铃薯甲虫体液部分降解，而PEI与dsRNA结合形成复合物，提高了dsRNA的稳定性，抑制了dsRNA在虫体内的降解。马铃薯甲虫腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA对马铃薯甲虫低龄幼虫毒力高于高龄幼虫，对雌成虫生殖能力具有一定的抑制作用。dsRNA大肠杆菌菌体可在24h内保存。马铃薯甲虫体液对dsRNA具有显著降解作用，PEI可保护 dsRNA，抑制dsRNA在虫体内的降解。

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第一章 文献综述

1.1马铃薯甲虫概论

1.2. 保幼激素的研究进展

1.3. 基于马铃薯甲虫保幼激素途径的RNAi干扰技术

第二章 腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA(dsSAHase)对马铃薯甲虫幼虫毒力测定及对马铃薯甲虫成虫繁殖能力影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3. 结果与分析

2.4 结论与讨论

第三章 储存条件对表达dsSAHase 大肠杆菌菌体活性影响

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 结论

3.5 讨论

第四章 马铃薯甲虫体液对dsRNA的降解及聚乙烯亚胺（PEI）对dsRNA的保护作用

4.1 前言

4.2 试验材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 结论

4.5 讨论

全文总结

参考文献

致谢

作 者 简 介