利用DGE技术筛选鸡×鹌鹑杂交种胚胎早期死亡相关基因

摘要

鸡与鹌鹑之间的杂交属于非常典型的属间远缘杂交,其杂交后代早期胚胎出现雌性大量死亡,且主要集中在孵化的第3-5天,该时间段刚好与其性别分化的时间相吻合,已有研究表明性别分化相关基因与其死亡存在一定相关性,与性别分化的调控机制比较复杂,参与的基因也很繁多,通过建立数字表达谱,筛选该时期特异表达的与性别分化相关的基因,为更好的研究鸡与鹌鹑杂交后代在胚胎发育早期雌性胚胎死亡和性别分化的机理奠定基础。
　　因此,本研究以鸡、鹌鹑及其杂交后代发育早期的胚胎为试验材料,通过形态学观察和分子生物学方法对其进行准确的性别鉴定后,采用Illumina测序技术对孵化到第3天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序,分别构建了雌性和雄性个体发育第3天的6个DGE文库,筛选它们之间的差异表达基因,分析其在表达趋势与测序结果是否一致,并对与性别分化相关的基因进行分析,旨在对比其同鸡与鹌鹑杂交后代早期胚胎死亡之间存在的关系,具体研究内容及结果如下:
　　(1)采集鸡、鹌鹑及其杂交种孵化第3-4.5天(每隔12h采样)的胚胎,通过体式显微镜观察发育各时期的形态。结果表明,杂交胚胎发育各时期的形态变化介于其父本鸡与母本鹌鹑的中间,各时期的形态发育与已有研究相一致,且鸡、鹌鹑及其杂交胚胎发育第3天的形态特征基本一致。与此同时,以未知性别鸡与鹌鹑杂交胚胎为研究对象,采取成年鹌鹑血液DNA为对照,用特异性引物2550F/2718R扩增出的鹌鹑W染色体上染色体螺旋蛋白基因(CHD)保守区作为对照进行性别鉴定,结果表明CHD基因法对孵化早期胚胎进行性别鉴定的准确率为100％,可以应用于家禽早期胚胎的性别鉴定,同时保证了本研究采样的准确性。
　　(2)以形态学和DNA水平扩增CHD基因进行准确性别鉴定为基础,通过Illumina测序平台对孵化第3天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序,分别构建了雌性和雄性个体发育第3天的6个DGE文库,筛选它们之间的差异表达基因,并对GO分析和KEGG通路等进行统计。结果显示,雌雄鸡、雌雄鹌鹑、雌雄杂交禽胚胎比对到参考基因组的序列分别有2840108、2817776、1343632、1279590、1844727和1824082条;雌雄鸡、雌雄鹌鹑、雌雄杂交禽、雌鸡与雌杂交禽、雌鹌鹑与雌杂交禽的差异表达基因分别有66、1340、72、130和605个,与性别分化相关的差异表达基因分别有4、2、3、9和8个,以雌雄杂交禽为实验组,其它四组为对照组筛选与雌性杂交禽胚胎早期死亡相关的差异基因,包含有HINTW、HINT1、cFOXL2的等基因。随机选择6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR),其表达趋势与测序结果一致,证明测序结果的真实性。然后对它们进行GO分析和KEGG通路分析表明,这些差异表达基因主要参与了Wnt、p53、Osteoclast、PPAR、TGF-b和MAPK等与生长发育、生殖、细胞的增殖分化相关的信号通路。对与性别分化相关差异表达基因分析发现,这些基因不但参与性别分化过程,而且均参与细胞的循环和分化过程,结合前人的研究,因此推测鸡与鹌鹑杂交后代雌性胚胎发育早期死亡与这些性别分化相关基因在细胞循环和分化过程表达的紊乱有关。
　　综上所述,利用Illumina测序平台对孵化第3天的鸡、鹌鹑、杂交胚胎进行高通量测序,分别构建了雌性和雄性个体发育第3天的6个DGE文库,筛选它们之间的差异表达基因,并对随机繺选出的差异表达基因进行Real-time PCR验证,与测序结果一致,结合GO分析和KEGG通路分析,找到与性别分化相关的差异表达基因(HINTW、HINT1等),为深入研究鸡(♂)′鹌鹑(♀)杂交后代早期胚胎死亡和性别分化提供理论基础和依据。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

第一章文献综述

1.鸡与鹌鹑属间远缘杂交研究进展

1.1远缘杂交概述

1.2鸡与鹌鹑属间杂交概述

1.3鸡与鹌鹑属间杂交种死亡的可能原因概述

2.家禽胚胎形态学研究进展

2.1家鸡胚胎发育形态学概述

2.2鹌鹑胚胎发育形态学概述

3.家禽性别控制研究进展

3.1家鸡性别分化研究进展

3.2家禽胚胎的分子鉴定研究进展

4.数字基因表达谱

5.本研究目的与意义

第二章 鸡、鹌鹑及其属间杂交早期胚胎形态学观察

1材料和方法

1.1材料

1.2胚胎采集及形态学观察

2结果与分析

2.1 3-4.5天鸡胚胎形态观察

2.2 3-4.5天鹌鹑胚胎胚胎形态观察

2.3 3-4.5天杂交种胚胎形态观察

3讨论

第三章 数字表达谱筛选性别分化相关差异表达基因基因

1 材料与方法

1.1 材料

1.2试剂与仪器

1.3 试验方法

2.5μmolTaq聚合酶

1.4 数字表达谱实验原理

1.5数字基因表达谱生物信息学分析

1.6数字基因表达谱(DGE)测序结果验证

2 结果与分析

2.1 胚胎组织性别鉴定

2.2 总RNA提取结果

2.3雌鸡与雄鸡数字表达谱的建立及差异基因的筛选

2.4 雌鹌鹑与雄鹌鹑数字表达谱的建立及差异基因的筛选

2.5 雌杂交禽与雄杂交禽数字表达谱的建立及差异基因的筛选

2.6 雌鸡与雌杂交禽数字表达谱的建立及差异基因的筛选

2.7 雌鹌鹑与雌杂交禽数字表达谱的建立及差异基因的筛选

3 讨论

3.1雌鸡与雄鸡数字表达谱的建立及差异基因的筛选的分析

3.2雌鹌鹑与雄鹌鹑数字表达谱的建立及差异基因的筛选的分析

3.3雌杂交禽与雄杂交禽数字表达谱的建立及差异基因的筛选的分析

3.4雌鸡与雌杂交禽数字表达谱的建立及差异基因的筛选的分析

3.5雌鹌鹑与雌杂交禽数字表达谱的建立及差异基因的筛选的分析

全文结论

创新点

参考文献

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表