牛病毒性腹泻病毒新疆流行株的分离鉴定及E2基因遗传变异研究

摘要

牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD)是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)引起的牛的一种急性、热性传染病,主要表现为腹泻、粘膜脱落、母畜流产、死胎和畸胎,持续性感染、免疫耐受与免疫抑制等。流行病学调查发现,该病在许多养牛业发达的国家和地区广泛流行,在我国有20多个省、市、自治区流行该病,并且有较高的感染率。新疆北疆作为新疆畜牧业的重要产区,近年来引种数量较大,牛、羊存栏量较多,贸易频繁,导致BVD的广泛流行。为了对北疆地区BVD进行有效防控,开展新疆北疆BVDV分子流行病学调查,弄清本地区BVDV流行株基因型和遗传变异情况具有重要的意义。
　　本研究对采集新疆北疆地区疑似BVDV感染牛病料进行BVDV核酸检测,选取阳性样品进行BVDV的分离鉴定,并对流行株E2基因进行克隆及遗传变异分析。主要研究方法和结果如下:
　　1、新疆北疆部分地区BVDV分子流行病学调查研究
　　为了解新疆北疆部分地区BVDV流行株的分子背景,本研究根据GenBank中公布的BVDV5?-UTR的基因序列,设计特异性引物,对采集的116份样品进行BVDV核酸检测,选取部分阳性样品经5?-UTR基因克隆测序后进行BVDV流行株基因分型研究。结果66份为阳性样品,感染率为56.90％,表明在北疆地区BVDV感染较为严重。随机选择的12份测序样品中,11份属于BVDV-1型,1份属于BVDV-2型。研究结果证实北疆地区是以BVDV-1流行占据优势地位,但也存在BVDV-2型感染。
　　2、BVDV-2新疆流行株的分离鉴定
　　对BVDV-2RT-PCR检测阳性样品处理后接种MDBK单层细胞,进行BVDV流行株的分离鉴定。结果成功分离出1株可产生明显细胞病变(CPE)的BVDVcp型毒株。该毒株引起的CPE主要表现为病变细胞逐渐变圆、脱落,聚集成堆,出现拉网,脱落死亡。通过对该分离株的E2部分基因扩增、测序和序列比较,进一步证实所分离的毒株(BVDV2-SW)为BVDV-2型。
　　3、BVDV新疆流行株E2基因的克隆与遗传变异分析
　　利用套式PCR方法扩增BVDVE2基因全长,克隆、测序后与国内外不同地区BVDVE2基因进行比较分析。结果成功克隆了BVDV-SW和BVDV2-SW流行株E2基因,长度为1120个核苷酸。序列分析发现,BVDV-SW流行株E2基因核苷酸序列与国内分离株changchun184株,新疆分离株Manasi株和MNS2株同源性为86%;推导氨基酸序列同源性为84%。与NADL株和C24V株相比,其核苷酸和推导氨基酸序列同源性均低于80%。BVDV2-SW流行株与XJ-04和890株的核苷酸同源性分别为87%和84.7%,推导氨基酸同源性分别为80.8%和79.9%。遗传进化分析显示,BVDV-SW和BVDV2-SW流行株在基因分型上分别属于BVDV-1和BVDV-2。抗原表位优势区域BVDV-SW与shihezi148基本一致,而BVDV2-SW与890和XJ-04相同。BVDV-SW和BVDV2-SW流行株E2基因均存在变异现象。

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第一章 文献综述牛病毒性腹泻-黏膜病研究进展

1 BVDV生物学特征

2 BVDV分子生物学特征

3 BVDV感染与流行情况

4 BVD防控策略

第二章 实验研究实验一 新疆北疆部分地区BVDV分子流行病学调查研究

1材料与方法

2 结果

3讨论

实验二 牛病毒性腹泻病毒2型新疆流行株的分离鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验三 BVDV 新疆流行株E2基因的克隆与遗传变异分析

1材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

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