4株布鲁氏菌弱毒株对小鼠毒力及免疫保护力的评价

摘要

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种广泛流行的、人畜共患的慢性传染性疾病，不仅给畜牧业造成重大经济损失，而且严重危害着人类健康；另外，布鲁氏菌还被用作生物恐怖武器，对国家安全世界的和平造成严重的威胁。近年来布病的发病率呈上升趋势，布鲁氏菌病的发病特点是一旦发病并转入慢性就无法彻底治疗。目前，接种疫苗是预防和控制布鲁氏菌病流行的主要措施和手段。我国现有兽用布鲁氏菌疫苗菌株有3种，分别为羊种布鲁氏菌M5弱毒株、猪种布鲁氏菌S2弱毒株和牛种布鲁氏菌S19弱毒株。20世纪70-90年代，这3种疫苗对我国布病疫情的防控起了至关重要的作用，迄今为止，这3种疫苗在我国仍然被广泛使用，在一些欧美国家粗糙型流产布鲁氏菌疫苗RB51(B. abortus RB51)主要应用于牛布病的防治，并且被广泛应用，然而布鲁氏菌病疫苗在不同国家、不同地区的应用和报道不一，本实验对目前市场化的4株疫苗进行评价，旨在对生产实践提供一定的指导作用；同时由于RB51弱毒株的突变基因尚不明确，因此对RB51与LPS相关的27个主要毒力基因进行测序分析，旨在为新型疫苗的研究提供一定的参考。
　　本研究主要内容包括：⑴4种布鲁氏菌弱毒株对小鼠毒力及免疫保护力的评价。为系统比较我国现有布鲁氏菌病疫苗株S19，M5和S2及国外广泛应用疫苗株RB51的毒力及免疫保护力的强弱，本实验以上述4种疫苗株分别进行了以100:1的 MOI侵染小鼠巨噬细胞的胞内存活实验，发现在胞内存活能力RB51>M5>S19>S2；以1×106CFU/只免疫昆明小白鼠，脾脏指数法测定细菌毒力，测定各组疫苗株在小鼠脾脏中的定居能力，结果发现M5≥S19>S2≥RB51；待疫苗株在小鼠体内清除后，腹腔内接种布鲁氏菌强毒株2308以1×105CFU只进行攻毒检测保护力，结果发现M5的保护效果最好；分别分离免疫后第1-10周血清，ELISA检测血清中IgG滴度及细胞因子IFN-γ的表达水平，检测各个疫苗株的抗体随时间的免疫消长水平，结果发现IgG水平S2、M5组总体高于其他组，而各组IFN-γ水平总体上差异不显著（P>0.05）；虎红平板凝集试验(RBPT)和标准试管凝集试验(SAT)检测血清凝集状况，结果发现S2组、S19组抗体持续时间较其他组长；同时无菌采取免疫不同布鲁氏菌疫苗株脾脏、肝脏、肾脏等组织做病理切片观察病理学变化差异，结果发现M5组的病变较其他组最强。⑵布鲁氏菌RB51弱毒株和2308菌株LPS相关毒力基因差异。粗糙型布鲁氏菌RB51疫苗弱毒株是光滑型牛种布鲁氏菌2308株通过体外或体内连续传代培养得到的变异菌株，但目前对RB51菌株确切的自然突变机制还尚不清楚，为了弄清毒力致弱的RB51株是否是由于O侧链不合成的原因所致，或者合成LPS的某些基因受阻或缺失或突变所引起，因此本实验通过以RB51和2308菌株为模板进行PCR聚合酶链反应，并对LPS主要的26个毒力基因进行分子水平的测序分析。通过同源性分析比对结果发现，相对于2308株，RB51在其基因组wboA基因中插入了序列大小为844bp的序列，但其他毒力基因分析比对同源性基本一致。这为进一步的了解布鲁氏菌的分子致病机理以及后续的菌株改造疫苗的生产等方面提供了参考。

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引言

第一章 文献综述布鲁氏菌病疫苗的研究进展

1 布鲁氏菌生物学特性

1.1 布鲁氏菌的分类与特点

1.2 布鲁氏菌的发现历程

1.3 布鲁氏菌病危害

2 布鲁氏菌疫苗的应用现状

2.1 布鲁氏菌病活疫苗

2.2 布鲁氏菌病灭活疫苗

3 新型疫苗的研究状况

3.1 VTRM1、VTRS1突变株疫苗

3.2 L7/L12蛋白

3.3 布鲁氏菌胞质结合蛋白（Periplasmic binding protein, P39）

3.4 热休克蛋白GroEL

3.5 外膜蛋白Omp31(Outer membrance protein 31)

3.6 Cu-Zn超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)

3.7 其他

结语

第二章 实验研究

实验一 4株布鲁氏菌弱毒株对小鼠毒力及免疫保护力的评价

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

实验二 布鲁氏菌RB51弱毒株和2308菌株LPS相关毒力差异基因分析

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

致谢

作者简介

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