TMEM16A和TMEM16B在CCI模型鼠DRG神经元上的表达

摘要

目的：比较正常大鼠、坐骨神经压榨性损伤（Chronic Constriction Injury，CCI）模型鼠及不同浓度尼氟灭酸（Niflumic Acid，NFA）干预后的CCI模型鼠的热缩足反射潜伏期（Thermal Withdrawal Latency，TWL）的改变，及各组大鼠DRG神经元上TMEM16A和TMEM16B的mRNA水平和蛋白表达的改变，旨在探讨钙激活氯通道（calcium-ctivated chloride channels，CaCCs）在神经病理性痛（Neuropathic pain，NPP）中的调节作用。
　　方法：制作CCI模型；运用热板实验分别在术前1 d，术后第1、3、5、7、9、12、14d检测正常大鼠、CCI模型鼠及10μM、50μM和300μM的NFA干预后的CCI模型鼠的TWL；运用免疫荧光实验技术检测TMEM16A和TMEM16B在正常大鼠DRG上的分布；运用RT-PCR技术和Western Blot技术分别检测各组大鼠的DRG神经元上，TMEM16A和TMEM16B的mRNA水平和蛋白表达。
　　结果：（1）CCI模型鼠较正常大鼠TWL明显缩短（P<0.01，n=6），给予10μM、50μM和300μM的NFA干预后与CCI组相比TWL均明显延长（P<0.01,n=6），其中50μM的NFA干预组较10μM的NFA干预组的TWL也明显延长（P<0.01,n=6），但300μM的NFA干预组和50μM的NFA干预组之间的TWL无统计学差异。
　　（2）免疫荧光显示在正常大鼠DRG中，TMEM16A和TMEM16B主要表达在DRG神经元上。
　　（3）运用RT-PCR技术发现CCI模型鼠较正常大鼠 DRG神经元上的TMEM16A的mRNA水平明显上调（P<0.01，n=6），CCI模型鼠给予NFA干预后DRG神经元上的TMEM16A的mRNA水平显著下调（P<0.01，n=6），随着NFA干预浓度的增加，TMEM16A的mRNA水平呈浓度依赖性的下调（P<0.01，n=6）；CCI模型鼠 DRG神经元上的 TMEM16B的 mRNA水平明显下调；给予 NFA干预后TMEM16B的mRNA水平显著上调（P<0.01，n=6），随着NFA干预浓度的增加，TMEM16B的mRNA水平呈浓度依赖性的上调（P<0.01，n=6）。
　　（4）运用Western Blot技术发现CCI模型鼠与正常大鼠相比，DRG神经元上的TMEM16A的表达明显上调（P<0.01，n=6），CCI模型给予 NFA干预后，DRG神经元上的 TMEM16A的表达明显下调（P<0.01，n=6），随着 NFA干预浓度的增加，TMEM16A的表达呈浓度依赖性的下调（P<0.01，n=6）；CCI模型鼠DRG神经元上的TMEM16B的表达明显下调；给予NFA后，TMEM16B的表达显著上调（P<0.01，n=6），随着NFA干预浓度的增加，TMEM16B的表达呈浓度依赖性的上调（P<0.01，n=6）。
　　结论： NFA干预后CCI模型鼠DRG神经元上的TMEM16A和TMEM16B在转录和翻译水平均发生改变，提示TMEM16A和TMEM16B可能共同参与了神经病理性痛的产生。

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英文缩略语表

前言

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物及分组

1.2 主要实验仪器

1.3 主要实验试剂、耗材

1.4 主要实验液体配置

2 方法

2.1 CCI动物模型制作方法

2.2 NFA干预CCI模型的制备

2.3 热板实验及行为学观察

2.4 DRG神经元制备基本方法

2.5免疫荧光染色

2.6 蛋白提取的基本方法

2.7Western Blot实验基本步骤

2.8 RT-PCR实验基本步骤

2.9 统计学方法

结果

1 痛行为学检测

1.1模型大鼠足部状态及行为学观测

1.2热缩足反射潜伏期

2免疫荧光实验结果

2.1 TMEM16A和TMEM16B在DRG上的分布

3 RT-PCR实验结果

3.1 TMEM16A的mRNA水平的改变

3.2 TMEM16A的mRNA水平的改变

4 Western blot实验结果

4.1 NFA对CCI模型鼠DRG上TMEM16A蛋白表达的下调作用

4.2 NFA对CCI模型鼠DRG上TMEM16B蛋白表达的上调作用

讨论

结论和展望

1 结 论：

2 展 望：

参考文献

文献综述:钙激活氯通道CaCCs电生理特性及分子基础研究

致谢

作者简介

石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表