基于早孕因子检测的奶牛早孕诊断ELISA方法的建立

摘要

在奶牛的繁育过程中，奶牛的早期妊娠诊断非常重要。早孕因子（early pregnancy factor，EPF）是目前所知最早确认妊娠的生物化学标志物之一，是显示胚胎成活力的敏感标志。血清中早孕因子的检测可以预测胚胎的形成，监测胎儿生长状态，检测胚胎的早期消失。如果能在家畜上利用 EPF进行早期妊娠诊断，可以在配种后很短的时间内鉴别奶牛是否受孕，此技术缩短产犊间隔，节约生产成本，提高奶牛的繁殖率，同时也有利于育种员及时掌握配种情况，在实际生产中具有重要意义。
　　本研究运用基因工程技术克隆奶牛 EPF基因，构建原核表达载体 pET32a-EPF，获得奶牛早孕因子重组蛋白，通过切胶纯化的方法对表达的蛋白进行纯化，最终建立了奶牛早期妊娠诊断的间接 ELISA检测方法。利用该方法对怀孕28天的奶牛血清样品进行检测，结果发现，鼠抗牛 EPF多克隆抗体与孕酮、人绒毛膜促性腺激素均不发生交叉反应；早孕因子重组蛋白的最低检出限为320ng/mL；妊娠奶牛血清样本的敏感性为91％（n=100）；批内和批间重复性试验变异系数均低于10%；与美国爱德士牛怀孕检测试剂盒的检测结果对比，本研究建立的 ELISA检测方法符合率为81.97%；对间接 ELISA法检测结果进行统计学分析表明，妊娠奶牛(n=99)比空怀奶牛(n=92)血清中 EPF活性高，且差异极显著(P<0.01)；2～3岁妊娠奶牛(n=55)血清中 EPF活性比4～5岁妊娠奶牛(n=28)高，且差异极显著（P<0.01）；2～3岁妊娠奶牛(n=55)与6～7岁妊娠奶牛(n=10)血清中EPF活性差异不显著；不同胎次奶牛血清中 EPF活性差异均不显著。
　　上述结果表明，本实验建立的基于奶牛早孕因子检测的奶牛早孕诊断间接 ELISA方法特异性强，敏感性高，重复性好，能够有效检出受孕奶牛的血清样本，为奶牛的妊娠诊断提供技术支持。

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英文缩略语

第一章 文献综述

1 早孕因子的研究进展

1.1 早孕因子的化学本质

1.2 早孕因子的来源

1.3 早孕因子的生物学作用

1.4 早孕因子的纯化与检测

1.5 早孕因子的临床应用

第二章 实验部分

实验一 奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达及纯化

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

实验二 奶牛早孕诊断间接 ELISA 方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 应用间接 ELISA 法检测奶牛血清中的早孕因子活性

1 材料

2 方法

3 结果

3 讨论

第三章 结论

创新点

参考文献

作者简介

致谢

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