绵羊磷脂酶Czeta(PLCζ)对绵羊卵母细胞的激活作用及早期胚胎发育的影响

摘要

目的：在我国绵羊的用途较多是肉毛兼用的家畜，因此在屠宰过程中会产生大量的卵巢组织。然而在现实生产中绵羊卵巢组织的利用率并不高，利用绵羊卵巢组织生产优质胚胎的技术研究发展缓慢，因而提高卵巢组织的重复利用率生产优质胚胎的技术是进一步要解决的问题。用卵巢组织生产优质胚胎可能主要是受卵母细胞激活效率的影响，当前主要是使用蛋白激酶抑制剂或其他人工激活方法激活卵母细胞。但这种激活方式不能使我们清楚地了解卵母细胞激活的机理，可能会对我们研究卵母细胞的激活机理产生误区，使我们不能确定对后期胚胎的发育是否会产生不利影响。因而，我们需要一种新的生物激活制剂来激活卵母细胞。经研究发现精子中存在一种特异性的激活因子，即磷脂酶Czeta（PLCζ）。研究证实它是通过增加卵母细胞胞质内Ca2+浓度来激活卵母细胞，并且能使早期胚胎正常发育。它的发现将会利于我们更进一步研究卵母细胞的激活机制和早期胚胎的发育，同时大量生产优质胚胎的技术也将会快速发展。在本试验中，初步探究绵羊磷脂酶Czeta(PLCζ)对绵羊卵母细胞的激活作用及早期胚胎发育的影响。
　　方法：(1)对实验室已构建好的重组质粒pEGFP-N1-PLCζ进行菌液PCR、双酶切鉴定，鉴定完成后进行大提重组质粒和空载体。采集绵羊卵巢组织挑选出卵母细胞，将重组质粒和空载体分组显微注射到绵羊MⅡ期卵母细胞，观察卵母细胞的激活情况。（2）培养显微注射重组质粒的卵母细胞22 h，然后对其进行荧光钙离子探针Rhod2-AM染色，并用激光共聚焦显微镜对卵母细胞及早期胚胎的发育过程中Ca2+动态变化进行扫描，并设立孤雌激活的卵母细胞为对照组。（3）培养显微注射重组质粒的卵母细胞，观察早期胚胎发育的全过程。
　　结果：(1)鉴定了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ，并将重组质粒pEGFP-N1-PLCζ显微注射到绵羊卵母细胞中，成功激活了卵母细胞使其孤雌发育。(2)用激光共聚焦显微镜采集到卵母细胞及早期胚胎发育过程中Ca2+动态变化。(3)显微注射重组质粒pEGFP-N1-PLCζ绵羊卵母细胞激活后，绵羊卵母细胞正常发育形成早期胚胎。
　　结论:(1)绵羊PLCζ的重组质粒注入MⅡ期卵母细胞可孤雌激活绵羊卵母细胞，并且能发育成正常的早期胚胎；(2)绵羊卵母细胞及早期胚胎发育过程中有Ca2+动态变化。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

论文中常用缩写词英汉对照表

前言

第一章文献综述磷脂酶C zeta（PLCζ）及早期胚胎发育的研究进展

1磷脂酶C的研究进展

2磷脂酶C zeta(PLCζ)的研究进展

3钙离子的激活机理

4卵母细胞的激活

5早期胚胎的发育

6研究目的及意义

第二章 实验内容

试验一 绵羊磷脂酶C zeta(PLCζ)基因对绵羊卵母细胞孤雌激活的初步研究

试验二 绵羊磷脂酶C zeta(PLCζ)基因对绵羊卵母细胞孤雌发育早期胚胎中Ca2+动态变化的初步研究

试验三 绵羊磷脂酶C zeta(PLCζ)基因对绵羊早期胚胎发育的影响

全文总结

创新点

参考文献

致谢

作者简介

导师评阅表