棉花转录因子GhSNAC3在逆境响应中的功能分析

摘要

中国是棉花重要的贸易国，棉花在我国国民经济中占有重要的位置。但是近年来由于粮棉争地严重，我国棉区正向盐碱、干旱、贫瘠的土地迁移。因此探究棉花基因在逆境胁迫中的响应途径具有重要的意义。NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，也是植物基因组中最大的转录因子家族。研究表明NAC具有多种生物学功能，广泛参与植物的生长发育、器官建成、激素信号转导和逆境胁迫响应等。
　　目的：为了发掘陆地棉NAC基因资源，鉴定并克隆得到陆地棉NAC基因，通过对GhNAC基因表达、转录性质和转基因研究，初步确定GhNAC基因在棉花抗逆响应中所起的功能。并通过VIGS技术和启动子分析对GhNAC基因的功能进一步进行验证。
　　方法：预测棉花中可能存在的NAC基因采用生物信息学方法；基因表达分析采用qRT-PCR技术；构建亚细胞定位载体 pBI221–GhSNAC3-GFP，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白定位情况；构建酵母转录激活载体pGBKT7-GhSNAC3，通过显色反应分析其转录活性；构建植物过表达载体pCAMBIA3301-pROKⅡ-GhSNAC3，叶盘法转化烟草并进行逆境胁迫分析；构建VIGS载体，通过农杆菌侵染棉花并进行盐胁迫分析；启动子核心元件扩增分析采用RT-PCR技术；转基因植株中组织差异性进行分析通过半定量PCR技术完成。
　　结果：(1)克隆得到了转录因子基因GhSNAC3，其cDNA序列长度为1072bp，编码276个氨基酸。基因含有2个内含子和3个外显子，且内含子具有典型的植物内含子特征。所编码的蛋白序列在N-末端含有NAM保守域。(2)瞬时表达试验结果显示，GhSNAC3蛋白定位于细胞核内；酵母转录激活试验显示，GhSNAC3基因具有转录激活活性。(3)基因表达分析显示GhSNAC3基因能不同程度地响应干旱、高盐和黄萎病胁迫处理。(4)转基因烟草干旱和盐胁迫分析显示，转基因植株在抵御盐和干旱胁迫上有不同程度的提升；VIGS试验显示，VIGS棉花幼苗在盐胁迫后抗性减弱且部分生育期延后。(5)分析克隆 GhSNAC3基因的启动子的1279bp，发现其启动子存在很多与生长发育、逆境胁迫、光响应等相关的顺式作用元件。(6)启动子转化烟草胁迫试验说明，GhSNAC3的启动子属胁迫诱导型启动子；半定量PCR试验说明GhSNAC3表达具有组织特异性。
　　结论：本研究从陆地棉中克隆并分析了NAC转录因子基因GhSNAC3和其启动子，该基因在棉花干旱、高盐和黄萎病的抗逆响应中具有一定的抵御作用，为棉花的育种改良提供了基因资源。并且 GhSNAC3的启动子属逆境诱导型启动子，GhSNAC3基因的表达具有组织特异性。

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符号说明

第一章 文献综述

1.1 前言

1.2 NAC转录因子的结构特征

1.3 NAC转录因子的生物学功能

1.4 棉花NAC转录因子研究现状

1.5 本研究的目的与意义

第二章 棉花GhSNAC3基因的克隆与序列分析

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 试验结果与分析

2.4 本章讨论

第三章 棉花GhSNAC3基因功能的研究

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 试验结果与分析

3.4 讨论

第四章 棉花GhSNAC3基因启动子的克隆与分析

4.1 试验材料与方法

4.2 试验结果与分析

4.3 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

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