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Abstract
英文词缩略表
前言
第一章 文献综述
1基于病原学的结核病与耐药结核病诊断方法
1.1结核病的传统细菌学诊断
1.2耐药结核病的细菌学检测
2结核病耐药机制及耐药结核病的分子诊断
2.1结核分枝杆菌对常用药物耐药的分子机制
2.2耐药结核病的分子诊断技术
3基于免疫学的结核病诊断方法
4展望
第二章 实验部分
实验一 喀什地区结核分枝杆菌分离株的药敏试验及耐药基因的突变位点的检测
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源
1.1.3主要仪器
1.2方法
1.2.1常用试剂的配置
1.2.2中性改良罗氏培养基及PNB/TCH鉴别培养基的制备
1.2.3分枝杆菌的培养与鉴定
1.2.4结核分枝杆菌临床分离株的药敏试验
1.2.5结核分枝杆菌基因组提取
1.2.6结核分枝杆菌耐药相关基因PCR及测序引物的设计
1.2.7耐药决定区的PCR扩增
1.2.8 PCR产物的纯化
1.2.9 测序及分析
1.2.10统计学分析
2 结果
2.1罗氏培养基制备及结核分枝杆菌培养
2.2临床分离株菌株鉴定及药敏试验结果
2.3 结核分枝杆菌相关耐药基因的扩增
2.4 DNA测序技术分析相关耐药基因突变位点
2.4.1利福平耐药基因RopB的突变特征分析
2.4.2异烟肼耐药基因KatG及InhA的突变特征分析
2.4.3链霉素耐药基因RpsL及rrs的突变特征分析
2.4.4氧氟沙星耐药相关基因gyrA突变特征分析
2.4.4乙胺丁醇耐药相关基因embB的突变特征分析
2.5比例法药敏试验与DNA测序在检测结核分枝杆菌耐药的相关性分析
2.5.1 DNA测序技术对耐利福平药物菌株相关耐药突变位点检测的价值评价
2.5.2 DNA测序技术对耐异烟肼药物菌株相关耐药突变位点检测的价值评价
2.5.3 DNA测序技术对耐链霉素药物菌株相关耐药突变位点检测的价值评价
2.5.4 DNA测序技术对耐氧氟沙星药物菌株相关耐药突变位点检测的价值评价
2.5.5 DNA测序技术对乙胺丁醇药物菌株相关耐药突变位点检测的价值评价
3讨论
3.1喀什地区菌株耐药情况分析
3.2耐药相关基因的突变位点分析
3.3 DNA测序技术与药敏试验在检测菌株耐药的一致性分析
实验二 结核分枝杆菌蛋白的原核表达与间接ELISA检测结核病抗体的初步建立与评价
1材料方法
1.1材料
1.1.1菌株、载体(质粒)来源
1.1.3主要仪器
1.2方法
1.2.1引物的设计合成
1.2.2结核分枝杆菌基因组提取
1.2.3结核分枝杆菌特异性蛋白的基因扩增
1.2.4 PCR产物的鉴定与纯化回收
1.2.5目的基因与克隆载体pMD-19T的连接
1.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备与连接产物的转化
1.2.7阳性克隆菌落的PCR鉴定
1.2.8目的基因测序
1.2.9质粒提取、T载体双酶切与片段回收
1.2.13质粒双酶切验证及转化至表达菌株的鉴、保菌
1.2.14阳性菌株的蛋白诱导表达
1.2.15重组蛋白的表达及最佳诱导时间的确定
1.2.16蛋白的可溶性鉴定及纯化
1.2.17纯化蛋白的浓度测定
1.2.18重组蛋白Western Blot验证
1.2.19间接ELISA蛋白最佳包被浓度、待测血清及二抗最佳稀释比例的确定
1.2.20间接ELISA最佳封闭液的确定
1.2.21血清最佳孵育时间的确定
1.2.22酶标二抗最佳孵育时间的确定
1.2.23底物最佳作用时间的确定
1.2.24阴阳样本性临界值的确定
1.2.25临床样本的检测及灵敏度、特异性的分析评价
2 结果
2.1结核分枝杆菌基因的扩增
2.2目的基因与pMD-19T载体重组质粒构建
2.3目的基因与原核表达载体重组构建
2.4目的蛋白的表达及纯化
2.5蛋白浓度测定
2.6蛋白Western Blot分析
2.7间接ELISA检测结核病抗体方法的建立
2.7.1间接ELISA最佳封闭液的确定
2.7.2血清及二抗最佳孵育时间的确定
2.7.3底物显色时间的确定
2.7.4 Cut-off值的确定
2.8各蛋白在检测结核病能效的分析评价
3讨论
3.1结核分枝杆菌蛋白在原核表达系统的表达纯化
3.2结核病抗体检测的诊断能效
实验三 γ干扰素释放试验（IGRAs）刺激原的筛选鉴定
1材料方法
1.1材料
1.1.3主要仪器
1.2方法
1.2.1候选诊断蛋白的T细胞免疫原性预测
1.2.2蛋白内毒素的去除
1.2.3外周血淋巴细胞的分离
1.2.4 T-SPOT.TB试验
1.2.5 IFN-γ释放试验
1.2.6双抗体夹心人IFN-γ定量ELISA方法建立
1.2.6.1包被抗体浓度及标记抗体稀释比例的确定
1.2.6.2双抗体夹心ELISA最佳封闭液的确定
1.2.6.3最佳孵育时间的确定
1.2.6.4标记抗体最佳孵育时间的确定
1.2.6.5底物最佳作用时间的确定
1.2.6.6人IFN-γ标准曲线的建立
1.2.7检测结果判定
1.2.7.1 T-SPOT.TB试验结果判断标准
1.2.7.2 IFN-γ释放试验结果判断标准
2 结果
2.1 T细胞表位的预测
2.2 T-SPOT.TB试验结果
2.3双抗体夹心人IFN-γ定量ELISA方法建立
2.3.1包被抗体浓度及标记抗体稀释比例的确定
2.3.2双抗体夹心 ELISA最佳封闭液的确定
2.3.3待测样品最佳孵育时间的确定
2.3.4酶标抗体最佳孵育时间的确定
2.3.5底物最佳作用时间的确定
2.3.6人IFN-γ浓度标准曲线的建立
2.4单个刺激抗原的筛选与评价
2.5组合刺激抗原的筛选与评价
3讨论
3.1 IGRAs结果在不同地区存在差异的原因
3.2刺激抗原的筛选结果分析
3.3影响IGRAs结果的因素
第三章 全文总结
创新点
参考文献
附录一：间接ELISA检测结核病IgG抗体方阵滴定结果
附录二：间接ELISA检测结核病IgM抗体方阵滴定结果
附录三：最适封闭液的确定
附录四：血清及二抗最适孵育时间的确定
附录五：底物最佳作用时间的确定
致谢
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