结肠平滑肌细胞培养方法的建立及东北鹤虱松弛肠平滑肌作用初探

摘要

目的：建立离体大鼠结肠平滑肌细胞分离、纯化、原代培养及鉴定的方法，在细胞水平研究东北鹤虱药物血清的平滑肌松弛作用机制。 方法：1.采用混合酶法即胰蛋白酶消化杂细胞，胶原酶Ⅱ消化平滑肌细胞，分次消化、分次收集细胞，配合机械法吹打、过细胞筛得到细胞悬液，用含10％胎牛血清的DMEM液培养细胞，通过台盼兰染色法检查细胞数量及存活率，差速贴壁法纯化细胞，原代培养的细胞绘制生长曲线。2.新分离平滑肌组织常规甲醛固定、石蜡包埋、HE染色鉴定组织纯度，免疫组织化学ABC法用特异性平滑肌肌动蛋白α-actin鉴定原代培养细胞。3.分别用东北鹤虱水提醇沉溶液5g/mL、10g/mL、15g/mL给大鼠灌胃，每天一次，连续7天，末次灌胃后2小时下腔静脉取全血，离心后取上清液(含药血清)，用MTT比色法测定含药血清对结肠平滑肌细胞增殖的影响，通过细胞培养液的LDH检测含药血清的细胞毒性，测微尺测量给药前后细胞长度，计算舒张百分数，应用Ca3+荧光指示剂Fura-2/AM测定结肠平滑肌细胞内游离Ca2+浓度。 结果：成功分离出大鼠结肠平滑肌细胞，存活率＞95％，新分离的细胞呈椭圆形或梭形，胞核位于中央。含10％胎牛血清的DMEM培养36小时后细胞贴壁，细胞生长呈明显的迟滞期(第0-3天)，对数期(第3-7天)和平台期(第7-10天)，第十天左右融合成单层。平滑肌条病理切片镜下见细胞呈红色梭形，排列整齐，胞浆丰富，胞核呈紫蓝色，雪茄烟状。免疫组化见细胞呈梭形或多角形，胞浆内棕色及浅棕色细颗粒，核呈浅蓝色，为阳性反应，显示培养的CSM细胞纯度较高。含药血清(10倍稀释)作用于细胞后MTT测定显示与空白对照组比较，低浓度LEG组对细胞有明显的促进增殖作用(P＜0.01)，而中、高浓度组与空白对照组无显著性差异。细胞培养液的LDH检测结果显示低浓度组LDH明显低于空白对照组(P＜0.01)，提示LEG对细胞损伤有保护作用，而中、高浓度组LDH明显高于空白对照组(P＜0.01)，提示过高浓度含药血清会对细胞造成损伤或促进凋亡。含药血清(20倍稀释)作用于CSM细胞，与空白对照组比较，低、中、高浓度组细胞舒张百分数分别为3.69％、8.38％、10.39％，LEG含药血清对CSM细胞的松弛作用呈一定的剂量-效应关系。在胞外钙离子正常存在条件下，Ach(10μmol/L)能使[Ca2+]i增加，升幅达108.5％，Ver(5μmol/L)预处理细胞后，能显著抑制Ach诱导的[Ca2+]i升高，降幅为41.4％，低、中、高浓度LEG含药血清(100倍稀释)预处理细胞，对Ach诱导的[Ca2+]i升高均有抑制作用，降幅分别为3.8％，5.4％，14.0％，但只有LEG-H有显著性意义。细胞外钙为零时，Ach(10μmol/L)能使[Ca2+]i增加，增幅达66.4％，10mmol/Lcaffeine(caf)能使[Ca2+]i升高，增幅达175.6％，procaine(pro)10mmol/L预处理细胞能显著抑制caf诱导的[Ca2+]i升高，降幅为35.1％，低、中、高浓度LEG含药血清(100倍稀释)预处理细胞后，对caf诱导[Ca2+]i升高均有降低作用，降幅分别为4.2％，14.6％，17.9％，以中、高剂量LEG含药血清的作用非常显著。Ach增加细胞内Ca2+浓度，既能增加外钙内流，又能促进内钙释放。Ver和高浓度组LEG含药血清能抑制Ach增加[Ca2]i的作用，caf通过促进胞内Ca2+经肌质网RyR通道释放到胞浆而增加[Ca2+]i，pro、中剂量和高剂量组LEG含药血清能拮抗caf增加[Ca2+]i的作用。 结论：应用酶解法得到急性分离的大鼠结肠平滑肌细胞，经过差速贴壁、原代培养可以得到纯化细胞。此方法重复性好，纯度高，效果稳定。在细胞培养与中药血清药理学相结合的研究中可以看到东北鹤虱药物血清能松弛结肠平滑肌细胞，拮抗Ach和caf引起的细胞内钙离子浓度增加，提示抑制细胞内钙释放是其松弛平滑肌作用的主要机制之一。东北鹤虱还有促进结肠平滑肌细胞增殖，减少急性损伤的作用。

目录

学位论文原创性声明及版权使用授权书

英文缩略语注释

前言

第一部分结肠平滑肌细胞原代培养方法的建立与鉴定

第二部分东北鹤虱含药血清对CSM细胞舒缩状态及细胞内钙离子浓度的影响

结论

参考文献

致谢