人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究及基因差异表达的微阵列分析

摘要

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究及差异表达基因的微阵列分析 骨髓间充质干细胞是多能干细胞，已有实验证明在体内和体外细胞因子作用下，可分化为骨、软骨和脂肪细胞，在体内参与组织更新、损伤的修复和重建。本研究探讨人骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的可能性。 1.材料和方法1.1人骨髓间充质干细胞的分离培养人骨髓标本来源于39岁男性健康志愿者。按骨髓穿刺的常规方法，抽取骨髓液5ml。肝素抗凝。DMEM+F12培养液稀释后，用人淋巴细胞分离液Ficoll(比重为1.077)密度梯度离心法，分离出单个核细胞。用DMEM+F12洗涤后，加入DMEM+F12与MCBD的混合培养液(3：2，V/V)，并加入10％胎牛血清(FCS)、2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/ml表皮生长因子(EGF)、10ng/ml胰岛素样生长因子(IGF)和双抗。24小时后，吸取培养液，连同未贴壁细胞弃去。贴壁细胞继续培养，每四天更换半量的培养液，12天后细胞融合时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化液消化后，细胞传代，每天观察生长情况。 1.2.诱导分化细胞传至第四代后，在培养液中加量bFGF至10ng/ml，加10ng/mlVEGF培养，每四天半量换液，定期观察细胞生长形态，于第0、14、24天分析细胞的表型和功能。 1.3流式细胞分析细胞收集后，用多聚甲醛固定后用流式细胞分析仪，分析CD34、CD45、CD54、CD106、HLA-DR、vWF及KDR的表达情况。 1.4ac-LDL摄取和UEA结合试验细胞培养到实验设计的时间，在消化传代时，在24孔培养板内放入适当大小盖玻片，0.1％明胶包被后，接种细胞后培养。待盖玻片上细胞融合后将DiI-ac-LDL以4μg/ml的浓度加入选定的培养孔内，在37℃、5％CO2下孵育4h。然后吸取培养液，多聚甲醛固定后，以10μg/ml的浓度加入UEA-FITC，37℃下孵育1h。吸取培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗2～3次。 1.5基因差异表达微阵列分析标本为经培养扩增至第四代的人骨髓间充质干细胞和向血管内皮细胞诱导分化后24天的细胞。提取RNA，RT-PCR合成扩增cDNA，用荧光标记后，与芯片上已点样的寡聚核苷酸杂交，洗片后，读取芯片上阵列的荧光信号值，两种细胞间，诱导前后同一基因的信号值比为2倍以上，即为差异表达基因。 2.结果1.1人骨髓间充质干细胞的分离培养人骨髓间充质干细胞经过24小时的培养，贴壁粘附在培养塑料培养瓶，换液弃未贴壁细胞，继续培养，细胞呈克隆样生长，12天后细胞融合。消化传代后细胞生长速度加快，约5～7天细胞即融合，可消化传代。培养扩增到第四代后时，细胞生长倍增稳定，开始诱导分化。 1.2流式细胞术检测诱导分化后，分别于第0天、14天和24天用流式细胞术检测细胞的表型，结果如下表：┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓┃0天14天24天┃┣━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┫┃CD34┃6.23％┃4.12％┃57.37％┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD45┃5.79％┃4.40％┃33.85％┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD54┃37.54％┃24.54％┃┃┣━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃CD106┃24.85％┃11.33％┃57.93％┃┃┃┃┃┃┣━━━━━━━━┻━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃3┃┃┃┗━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┛*数值为表达阳性细胞的百分率2.2ac-LDL摄取和UEA结合试验诱导分化24天后大部分细胞可摄取ac-LDL，并可结合UEA。 2.3入骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化后差异表达基因在选定的7267个基因中，差异表达的基因814个，新表达和表达增加信号值比率在8倍以上的基因72个，有多种编码粘附分子和细胞外基质、血管内皮细胞功能相关蛋白和受体基因等。 3.讨论骨髓中至少有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞。与造血干细胞不同，间充质干细胞缺少特异性细胞表面抗原，常利用其粘附能力即贴壁法分离。在胎胚发育过程中，造血过程和内皮细胞的发育是非常相似的过程，导致人们提出设想，即这两个细胞系可能起源于共同祖先，即成血液血管细胞(angioblasts)。 骨髓间充质干细胞是多能干细胞，可分化为骨、软骨、脂肪细胞、造血支持间质和骨骼肌，也可以诱导分化为肝细胞、心肌细胞、肺及消化道的上皮细胞，表明骨髓间充质细胞具有可塑性。 已有体内实验和动物细胞的体外培养实验证明，骨髓间充质干细胞可诱导分化为内皮细胞。Quirici等从骨髓中分离出AC133+细胞，培养扩增，用VEGF诱导分化，部分细胞由圆形逐渐出现突起，呈纺锤状鹅卵石样排列，并呈内皮细胞表型。Gehling等在肿瘤患者的白细胞去除术中的白细胞中分离出AC133+细胞，亦可诱导分化为内皮细胞。说明骨髓中存在可诱导分化为内皮细胞的干细胞(祖细胞)。Reys等在人骨髓间充质干细胞中分选出多潜能成体祖细胞4┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┓┃vWF┃18.36％┃40.06％┃70.95％┃┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━┫┃KDR┃6.27％┃1.69％┃43.67％┃┃┃┣━━━━━━━╋━━━━━━┫┃HLA-DR┃11.01％┃10.05％┃26.98％┃┗━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┛(MAPCs)也可诱导分化为具有内皮细胞表型的细胞。这些细胞在骨髓间充质干细胞中稀少，培养扩增困难。本实验探索了用VEGF直接诱导人骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性。 在加入VEGF诱导后24天，经流式细胞术检测，细胞的CD34、CD45、KDR表达变为阳性，而CD54、CD106、vWF、HLA-DR表达量明显增加。大部分细胞可摄取ac-LDL，并可结合UEA，提示细胞具有内皮细胞的表型。这种诱导分化成的具有内皮细胞表型的细胞在形态学上变化不大，仍呈梭形或多角形，并未出现内皮细胞培养时所具有特征性的铺路石样排列，这种人工环境下培养并诱导分化的内皮细胞与真正的内皮可能还是不同的 在基因芯片检出的差异表达基因中，有多种编码粘附分子和细胞外基质、血管内皮细胞功能相关蛋白和受体基因，这些蛋白在血管新生、内皮功能的支持等方面有着重要的作用，其中血管细胞间小粘附因子1、细胞间粘附因子1，特别是氧化低密度脂蛋白受体1和血管内皮细胞生长受体1具有血管内皮细胞特异性，提示细胞分化成熟。

目录

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英文缩略语

第一部分人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

第二部分人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化后差异表达基因的微阵列分析

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

小 结

文献综述 血管内皮细胞分化发育的分子生物学机制

致谢