细胞因子与表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润关系的研究

摘要

大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，大肠癌肝转移是影响其长期生存的重要因素。进行大肠癌根治性切除术后的病人近一半由于疾病复发在5年内死亡，绝大多数发生肝转移。大肠癌以肝转移最为常见，发生肝转移率为50％左右。大肠癌肝转移的患者仅5％～10％可得到肝切除的机会，肝转移切除术后患者5年存活率达20％～40％(1)。绝大多数的肝转移由于肿瘤的数目、大小、位置及病人的全身状况不允许被切除。肝转移是大肠癌晚期患者死亡的主要原因。大肠癌肝转移包括多个步骤，癌细胞从原发部位侵入血管，与肝血管内皮细胞附着，穿透进入肝实质并定居。众所周知，肿瘤细胞的侵袭及其逃避机体免疫监控是肿瘤转移的要素。肿瘤转移的结果依赖于恶性细胞与宿主环境复杂的相互作用。通过改变肿瘤细胞增殖与死亡的平衡，恶性细胞与宿主环境的相互作用可影响原发癌的生长及转移。 凋亡或程序化细胞死亡在正常细胞调控中起重要作用，同时被细胞内外的各种信号所调控。Fas抗原(APO-1/CD95)与Fas配体(FasL)组成的Fas系统，在将凋亡信号转导入细胞内发挥重要作用。效应细胞FasL结合靶细胞Fas抗原后，在数小时内通过细胞凋亡途径使靶细胞死亡。近年来很多研究发现，Fas在多种细胞表面均有表达，而FasL表达只限于少量细胞类型，诸如淋巴细胞、免疫特权器官的细胞和多种恶性肿瘤细胞，同时已证实表达FasL的肿瘤周围激活的Fas阳性淋巴细胞凋亡异常增加。另一方面，肿瘤的发生在很大程度上是因为转化的细胞不能正常凋亡所致。根据早期的文献，通过表达Fas配体及对Fas介导凋亡途径的抵抗可能会使多种肿瘤对机体免疫系统进行优先攻击或反击。 大肠癌病人肝转移的高发病率表明肝提供了有助于转移发生的环境。转移的瘤细胞必须逃逸免疫监视，在继发部位侵袭和替代局部组织才能形成转移瘤。肿瘤侵袭的一些机制包括：降解细胞外基质的金属蛋白酶的释放，促进新生血管形成的生长因子的分泌，促进肿瘤细胞迁移的粘附分子的改变。然而，虽然替代正常组织是肿瘤生长的前提，但大肠癌替代和破坏肝细胞的确切机制却不为人所知。肝细胞对Fas介导的凋亡特别敏感，因为注射抗Fas抗体可诱导肝脏的严重损伤，而在别处并未发生。最近发现，肿瘤细胞表达FasL对肿瘤细胞在肝定居上起着关键作用。Yoong等(2)证实肠癌肝转移瘤边缘的肝细胞Fas表达被显著上调，许多肝细胞遭受凋亡。阐明肿瘤和其微环境的相互作用提高了医生对转移形成的生物学机制的理解。制定有效的生物疗法将依赖于正常细胞与肿瘤细胞复杂交互作用的理解，以及细胞因子与在特定位置特定肿瘤内所有细胞的相互作用。 本研究的目的是研究体外细胞因子对表达Fas配体人结肠癌细胞肝转移及浸润的影响。 第一部分细胞因子促进表达Fas配体人结肠癌细胞免疫逃逸目的：探讨结肠癌细胞自身表达FasL的作用和内源性细胞因子对肿瘤细胞反击T淋巴细胞的影响。方法：用免疫组织化学SP法及RT-PCR法观察结肠癌细胞系和JurkatT淋巴细胞系Fas与FasL的表达，为结肠癌细胞和JurkatT淋巴细胞Fas和FasL的功能提供mRNA水平及形态学依据。采用非放射性细胞毒分析，测定SW620结肠癌细胞与Jurkat靶细胞共培养后LDH释放值检测效应细胞的杀伤效应。结果：PMA加离子霉素刺激后或TNF-α刺激后或IL-18刺激后大肠癌SW620细胞FasLmRNA水平明显上调。结肠癌SW620细胞FasL染色呈阳性反应，阳性反应物主要定位于癌细胞的胞膜及核周区，而Fas染色几乎呈阴性反应。Jurkat细胞系Fas、FasL免疫组化染色呈阳性反应，阳性反应物主要定位于癌细胞的胞膜。CytoTox96~非放射性细胞毒分析显示PHA激活的靶T细胞(JurkatT细胞)分别与PMA加离子霉素刺激(48h)后或TNF-α刺激(48h)后或IL-18刺激(36h)后或未刺激的大肠癌SW620效应细胞共培养4小时，在E:T为10:1，5:1，2.5:1，1.25:1细胞毒杀伤效应分别为74.6％，40.8％，32.4％，10.9％(F=8.19，P＜0.05)；54.9％，35.3％，22.0％，10.3％(F=11.12，P＜0.05)；52.5％，33.1％，19.8％，10.1％(F=9.19，P＜0.05)和14.9％，10.5％，6.9％，5.8％(F=3.45，P＜0.05)。未刺激的SW620细胞与PHA激活的Jurkat细胞共培养8小时，在E:T为5:1，2.5:1，1.25:1细胞毒杀伤效应分别为83.9％，74.1％和28.5％(F=137.04，P＜0.05)。非放射性细胞毒分析显示大肠癌SW620细胞系与激活的T细胞(JurkatT细胞)共培养后，随着SW620接种浓度增加和共培养时间的延长，JurkatT细胞凋亡的比例显著增加。PMA加离子霉素或TNF-α或IL-18能显著增强大肠癌的细胞毒活性。结论：宿主微环境中的内源性细胞因子调控人结肠癌细胞FasL表达，有助于肿瘤细胞逃逸机体免疫监视系统。 第二部分大肠癌肝转移中Fas/FasL的相互作用与细胞因子关系的研究目的：探讨内源性细胞因子和结肠癌细胞自身表达FasL的相互作用对大肠癌肝转移及浸润的影响。方法：采用免疫组织化学、RT-PCR法检测结肠癌细胞系和Chang肝细胞系Fas与FasL的表达，为结肠癌细胞和Chang肝细胞Fas和FasL的功能提供mRNA水平及形态学上的依据。采用非放射性细胞毒分析，测定SW620结肠癌细胞与Chang肝细胞共培养后LDH释放值检测效应细胞的杀伤效应。结果：TNF-α刺激后或IL-18刺激后大肠癌SW620细胞FasLmRNA水平明显上调。结肠癌SW620细胞FasL染色呈阳性反应，阳性反应物主要定位于癌细胞的胞膜及核周区，而Fas染色几乎呈阴性反应。Chang肝细胞Fas免疫组化染色呈阳性反应，阳性反应物主要定位于细胞的胞膜，而FasL染色呈阴性反应。CytoTox96(R)非放射性细胞毒分析显示IFN-γ刺激后的靶Chang肝细胞分别与TNF-α刺激(48h)后或IL-18刺激(36h)后或未刺激的大肠癌SW620效应细胞共培养6小时，在E:T为10:1，5:1，2.5:1，1.25:1细胞毒杀伤效应分别为73.5％，53.2％，24.1％，10.9％(F=89.73，P＜0.05)；68.3％，49.8％，21.1％，9.7％(F=76.87，P＜0.05)和32.7％，21.8％，11.1％，6.7％(F=7.27，P＜0.05)。非放射性细胞毒分析显示TNF-α或IL-18能显著增强表达FasL大肠癌细胞对Chang肝细胞的毒性。结论：宿主微环境中的内源性细胞因子调控人结肠癌细胞FasL表达，有助于大肠癌细胞在肝脏形成转移灶。

目录

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缩略词表

第一部分细胞因子促进表达Fas配体人结肠癌细胞免疫逃逸

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分大肠癌肝转移中Fas/FasL的相互作用与细胞因子关系的研究

总结

参考文献

综述1大肠癌肝转移的研究进展

综述2Fas/FasL与肿瘤关系研究的进展

简历

致谢