五肽化合物PLNPK肽对佐剂性关节炎的治疗作用及机理研究

摘要

目的： 研究五肽化合物PLNPK肽对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)的治疗作用，并初步探讨其可能的作用机制。 方法： 1．建立大鼠从动物模型；测量各组大鼠的踝关节周长，观察PLNPK肽对AA大鼠原发性及继发性踝关节肿胀的抑制作用；HE染色观察PLNPK肽对AA大鼠关节病理改变的影响；Vimentin、CD68和CD86免疫组化方法观察PLNPK肽对AA大鼠关节滑膜组织中成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes，FLS)的增殖、巨噬细胞浸润和活化的影响。 2．应用Ⅱ型胶原酶和胰酶联合消化方法培养AA大鼠关节FLS，建立体外AA大鼠原代关节滑膜细胞培养体系，用MTS法观察PLNPK肽在体外对FLS增殖的影响。提取AA大鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage，PEMψ)；PLNPK肽作用于PEMψ后，提取培养上清液，与AA大鼠FLS共同孵育，MTS方法观察PLNPK肽对AA大鼠FLS增殖的影响。 3．应用MTS法观察PLNPK肽体外对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响。应用MTS法和CD86免疫组化方法观察PLNPK肽体外对正常大鼠PEMψ增殖和活化的影响。应用MTS法和CD86免疫组化方法观察PLNPK肽体外对从大鼠PEMψ增殖和活化的影响。PLNPK肽作用于AA大鼠PEMψ后，提取培养上清液，应用ELISA方法观察PLNPK肽对巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-1β含量的影响。 结果： 1．给药剂量为200μg/kg/d和100μg/kg/d时，PLNPK肽可以减轻AA大鼠致炎侧及对侧踝关节肿胀，与生理盐水组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。 PLNPK肽能够明显改善AA大鼠关节的滑膜组织增生、炎细胞浸润及血管翳形成，减轻骨和软骨的损伤。PLNPK肽能够抑制AA大鼠关节滑膜组织中FLS的过度增殖和巨噬细胞的浸润，降低巨噬细胞的活化程度。 2．药物浓度为0.4-3.2mg/ml时，PLNPK肽对体外培养的FLS增殖无明显的抑制作用，与阴性对照组比较，差异没有统计学意义。药物浓度为0.8-3.2mg/ml时，PLNPK肽能够间接抑制FLS的增殖，其抑制作用有剂量依赖趋势，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，抑制率为17.89-35.49％。 3．药物浓度为0.8-3.2mg/ml时，PLNPK肽能够明显抑制体外培养RAW264.7细胞的增殖，其抑制作用有剂量依赖趋势，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，抑制率为21.24-81.68％。药物浓度为1.6-3.2mg/ml时，PLNPK肽能够明显抑制体外培养正常大鼠PEMψ的增殖，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，抑制率为21.32-77.80％；药物浓度为1.6-3.2mg/ml时，PLNPK肽能够明显减少体外培养正常大鼠PEMψ中CD86阳性的细胞数。药物浓度为0.8-3.2mg/ml时，PLNPK肽能够明显抑制体外培养从大鼠PEMψ的增殖，其抑制作用有剂量依赖趋势，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，抑制率为36.41-82.85％；药物浓度为0.4-3.2mg/ml时，PLNPK肽能够明显减少体外培养正常大鼠PEMψ中CD86阳性的细胞数。PLNPK肽药物浓度为0.2-3.2mg/ml和0.8-3.2mg/ml时，分别能够抑制体外培养AA大鼠PEMψ分泌IL-1β和TNF-α,抑制作用有剂量依赖趋势，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，抑制率分别为35.60-94.72％和40.70-79.32％。 结论： PLNPK肽能够抑制AA大鼠原发性及继发性踝关节肿胀，改善关节的病理损伤，其抗AA的作用可能机制是：抑制巨噬细胞的增殖、活化、减少炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，进而抑制FLS的增殖和活化，达到缓解AA的效应。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分 PLNPK肽对大鼠AA治疗作用的实验研究

实验一 PLNPK肽对AA大鼠关节肿胀的影响

实验二 PLNPK肽对AA大鼠关节病理损伤的影响

第二部分PLNPK肽对成纤维样滑膜细胞影响的实验研究

实验一PLNPK肽对体外培养佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖的影响

实验二PLNPK肽作用后腹腔巨噬细胞培养上清对成纤维样滑膜细胞增殖的影响

第三部分PLNPK肽对巨噬细胞影响的实验研究

实验一PLNPK肽对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖的影响

实验二PLNPK肽对体外培养正常大鼠腹腔巨噬细胞增殖和活化的影响

实验三PLNPK肽对体外培养佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞增殖和活化的影响

实验四PLNPK肽对体外培养佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-1β的影响

讨论

结论

参考文献

致谢