甲状腺激素受体β基因新外显子的克隆及其编码产物在大肠杆菌中的表达

摘要

甲状腺激素受体(thyroid hormone receptors,TRs)与糖皮质激素、雌激素以及孕激素等激素受体同属于核受体超家族成员。1972年Oppenheimer等运用标记的T<,3>在大鼠肝、肾组织细胞核中首次证实TR存在。目前研究表明编码甲状腺激素受体共有两个基因：TRα和TRβ，根据转录起始位置不同及可变性剪接，TRα基因可产生TRα<,1>，TRα<,2>，TRα<,3>，TR△α<,1>，TR△α<,2>；TRβ则产生TRβ<,1>，TRβ<,2>，TRβ<,3>，TR△β<,3>；其中TR△α<,1>，△α<,2>，△β<,3>分别是TRα<,1>，α<,2>，β<,3>的截短型同工体。我们在大鼠肝脏中发现了一种新的甲状腺激素受体亚型，它的cDNA序列比TRβ<,1>在相当于外显子3和4序列之间多108个碱基序列，已在NCBI的Gene bank注册，获得登记号DQ 191165，命名为TRβ△。这是目前已知的唯一的加长型TR亚型，加长部分位于外显子3和4之间，很可能在TRβ内含子3-4内存在一个新的外显子。 本文目的旨在克隆此108bp序列，表达其36个氨基酸残基的肽段，以期用作免疫原制备抗体。此抗体能特异识别TRβ△，从而检查其在各组织的分布和定位。我们利用聚合酶链反应(PCR)及反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分别从含有TRβ△的大鼠肝脏的基因组文库和总RNA及普通大鼠的基因组DNA和总RNA四种模板中扩增和克隆出相同的TRβ基因新外显子，将目的片段连入pGEM-TEasy载体中，测序确证后，将其酶切后插入原核细胞表达载体pGEX-3X，构建了pGEX-3X/exon重组质粒，经DNA测序确定后，将其转化大肠杆菌DH5α进行融合表达，行SDS-PAGE电泳，查看表达产物大小和表达量，并经Western-blotting进一步鉴定。表达条件经优化后，重组蛋白的表达量达到10mg/L培养基，占菌体蛋白的21.78％。包涵体变性、复性后，经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化，凝胶分析系统扫描显示表达产物纯度为91.97％，透析保存。此GST-36肽融合蛋白即可作为免疫原备用。

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