BMSCs介导HSV-TK/GCV系统联合连接蛋白CX43治疗恶性脑胶质瘤的体内外实验研究

摘要

恶性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。因为它们超强的迁移能力，瘤细胞常广泛侵袭进入正常脑组织，并可在远离主瘤床位点形成肿瘤卫星灶，而这些肿瘤灶也成为胶质瘤难以治愈、术后复发和病死率居高不下的主要原因。因此对于任何切实有效的治疗策略，靶向肿瘤卫星灶的治疗都是至关重要的。 与神经干细胞(NSCs)相比，骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其不受伦理学方面的限制，来源方便，近几年更多地被研究人员采纳。实验显示，基因修饰的BMSCs通过表达白介素2(IL-2)或干扰素β(IFN-β)，具有良好的胶质瘤趋向性的同时，在体内、外试验中还表现出良好的抗肿瘤作用。然而，在这些实验过程中也留下了许多相关问题，如BMSCs的肿瘤迁移特征和机制，长时间体外培养的BMSCs的性状稳定性以及作为基因载体治疗胶质瘤的效率等。 近几年的研究表明，虽然少数报告Ⅲ期临床实验效果并不满意，但单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦(HSVtk/GCV)自杀基因治疗系统从理论上仍被认为是最有前途的胶质瘤治疗手段之一，不论肿瘤发生的分子病理机制如何，HSVtk/GCV病毒介导的酶前体药物均可产生有效的肿瘤选择性细胞死亡。上述毒性分子还能从HSV-tk<'+>细胞进入HSV-tk<'->细胞，产生所谓的杀伤“旁效应”，而临床试验的效果不佳的重要瓶颈之一在于基因投递的效率过低；因此本研究拟利用BMSCs 的趋瘤性，将其作为HSVtk基因载体，同时为恢复多数胶质瘤细胞系缺失的细胞间隙连接通讯，将连接蛋白CX43转染于胶质瘤细胞，以期加强旁效应，提高自杀基因治疗疗效。 本研究分为三部分。 在第一部分首先使用当前较为成熟的原代贴壁培养法获得BMSCs，并就其表面标记抗原予以流式细胞术鉴定，结果符合BMSCs特征，证实BMscs培养成功；然后分别采用软琼脂克隆形成实验、血清依赖实验和流式细胞周期分析检测BMSCs的性状稳定性和生物安全性，这些结果显示长期体外培养的BMSCs具有相对稳定的基因表型，未见其明显的恶性转化。 第二部分在体内、外利用几个方法不同但内容相互补充的实验进行BMSCs的胶质瘤趋向性研究。在体外模型中，包括中央柱细胞分离培养体系、Matrigel球体共培养体系和Transwell迁移模型，从不同角度检测BMSCs的胶质瘤趋向性。结果显示，BMSCs的胶质瘤趋向性具有普遍性，但不同的胶质瘤细胞系具有不同的趋化能力，而且这种趋化潜能很可能来自肿瘤细胞自身外分泌的细胞因子。在体内试验，预先建立了大鼠C6胶质瘤模型，然后将BrdU标记的BMSCs经肿瘤对侧脑半球、颈动脉和股静脉移植接种入体内，用免疫学实验方法检测BMSCs在肿瘤模型内的分布情况。结果显示接种的BMSCs主要分布于肿瘤与正常脑组织交界部位，伴随或包裹周围浸润胶质瘤细胞或游离小灶。为研究BMSCs胶质瘤趋向性的可能机制，该部分检测了CXCR-4、MMP2、MMP9 3个与迁移密切相关的蛋白在BMSCs中的表达。结果显示不同培养时间的BMSCs可稳定表达CXCR4、MMP2、MMP9，并与其传代次数无关。 第三部分，以腺病毒为TK基因载体转染于BMSCs，同时转染CX43进入C6细胞。体内、外实验结果显示细胞间隙连接通讯可有效增强HSVtk/GCv治疗旁效应。将实验动物分为四组即C6、CX43-C6、TK-BMSC/C6和TK-BMSC/CX43-C6组。通过MRI对前六周各组实验鼠脑胶质瘤体积检测和连续120天动物生存期观察，发现在同一时间点CX43-C6较单纯C6组肿瘤体积要小得多，且动物生存期明显延长，而TK-BMSC/C6和TK-BMSC/CX43-C6组无论从肿瘤体积还是动物生存期均较以上各组显示出更好的肿瘤杀伤作用。随后在肿瘤内部与边缘进行的细胞核增殖抗原和细胞凋亡检测均显示出TK-BMSC/CX43/GCV治疗体系对包括肿瘤卫星灶在内的明显的胶质瘤杀伤作用。 上述实验结果显示具有肿瘤趋向性的BMSCs作为治疗前体药物载体靶向侵袭瘤细胞对脑胶质瘤治疗是一个有着良好应用前景的新手段。随着临床试验展开，大量的体外扩增及修饰，良好的迁移活性和肿瘤趋向性，BMSCs 的上述研究在成体干细胞对恶性胶质瘤治疗的临床应用研究中必将发挥其重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语

声明

引言

第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及长期培养的性状稳定性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分BMSCs的胶质瘤趋向性及其迁移机制的初步研究

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分BMSCs作为TK基因载体联合CX43治疗胶质瘤的体内外研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述一骨髓间充质干细胞在胶质瘤基因治疗中的应用

综述二干细胞在胶质瘤治疗中的研究进展

发表论文和参与科研情况

致谢