环维黄杨星D对大鼠在体回肠的作用及其机制研究

摘要

目的： 探讨中药单体环维黄杨星D（CVB-D）对大鼠在体回肠的作用，并进一步从细胞水平上探讨其作用机制。 方法： 1.经十二指肠插管给予不同浓度的CVB-D，利用BL-410生物机能实验系统观察CVB-D对大鼠在体回肠收缩幅度及频率的影响，并预先给予钙通道阻滞药硝苯地平以初步推断CVB-D对大鼠在体回肠的作用机制。 2.采用混合酶法（胶原酶、链霉蛋白酶E、牛血清白蛋白）分离培养大鼠回肠平滑肌细胞，绘制原代培养的平滑肌细胞生长曲线，并利用平滑肌肌动蛋白α-actin免疫组织化学染色进行鉴定。 3.利用MTT比色法测定CVB-D对大鼠回肠平滑肌细胞增殖的影响，通过细胞培养液的LDH检测CVB-D的细胞毒性。 4.应用钙敏感的荧光指示剂Fura-2，于荧光分光光度计上测定CVB-D作用后平滑肌细胞内游离钙离子浓度（[Ca2+]i），从细胞水平上探讨CVB-D的作用机制。 结果： 1.与生理盐水组比较，CVB-D低、中、高剂量组在给药110min后大鼠回肠的收缩幅度增强，且随着时间延长收缩幅度升高更为显著（P<0.05），并且各组药物之间具有剂量依赖性；而预先给予钙通道阻滞药硝苯地平可拮抗其对回肠的收缩作用（P<0.05）； CVB-D对回肠的收缩频率无显著影响（P>0.05）。 2.新鲜分离的回肠平滑肌细胞呈长短不一的梭形或椭圆形，细胞培养48h后，可见细胞已贴壁，3～5d细胞开始增殖，10 d后细胞密集，呈峰谷样生长，细胞长成致密单层时即可传代。免疫细胞化学检测结果显示：大部分多角形细胞胞浆内见棕色及浅棕色细颗粒，呈阳性反应，核不着色，呈浅蓝色。可见培养的平滑肌细胞纯度较高，几无成纤维细胞混杂。 3.MTT测定显示，低、中剂量CVB-D对平滑肌细胞有明显的促进增殖作用（P<0.01），而高剂量CVB-D则抑制细胞的增殖（P<0.05）。细胞培养液的LDH检测结果显示，低、中剂量CVB-D组LDH明显低于空白对照组（P<0.01），提示CVB-D对细胞有保护作用，而高剂量组LDH明显高于对照组（P<0.01），提示过高浓度CVB-D会对细胞造成损伤或促进凋亡。 4.当回肠平滑肌细胞悬液细胞外钙（[Ca2+]o）为1.5mmol/L时，CVB-D可诱发静息期[Ca2+]i升高，而预先给予维拉帕米可以抑制[Ca2+]i的升高，抑制率为17.9%；当[Ca2+]o为0mmol/L时，CVB-D仍可使[Ca2+]i升高，而普鲁卡因对[Ca2+]i升高的抑制率达29.2%。 结论： 大鼠回肠平滑肌受CVB-D刺激后，回肠的收缩幅度明显增加，作用机制可能与增加肠平滑肌细胞[Ca2+]i有关，而[Ca2+]i增加主要来源于两个途径，即细胞外Ca2+经电压依赖性钙离子通道内流及肌浆网雷诺定（ryanodine）敏感的贮存Ca2+释放。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

第一部分环维黄杨星D对大鼠在体回肠的作用

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学方法

结果

第二部分大鼠回肠平滑肌细胞的分离、培养与鉴定

一、实验材料

二、实验方法

结果

第三部分环维黄杨星D对大鼠回肠平滑肌细胞内游离钙离子浓度的影响

一、实验材料

二、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 中药防治再灌注心律失常的研究进展

致谢