巨噬细胞和苯妥英钠中介的旁分泌机制在心肌梗死后组织修复中的作用

摘要

心肌梗死后组织修复过程是影响心室重塑发展方向的决定因素。近年来的研究显示，苯妥英钠(PHT)可以通过介导旁分泌机制加速创伤修复，我们实验室的前期工作证实苯妥英钠可加速心肌梗死后组织修复，其可能机制是通过激活巨噬细胞，中介旁分泌机制。巨噬细胞在组织修复中是各种细胞因子和生长因子的重要来源。心肌梗死后早期移植巨噬细胞可促进血管新生、组织修复，改善心室重塑和心脏功能。然而苯妥英钠通过激活巨噬细胞促进心肌梗死后组织修复的具体机制尚不十分清楚。 目的：本实验建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，并在梗死后早期进行同种异体腹腔巨噬细胞心肌内移植，和PHT预刺激的腹腔巨噬细胞心肌内移植，以及梗死后14天持续给予PHT腹腔内注射，观察上述干预因素对组织病理学、分子生物学和血流动力学的综合影响，旨在探讨巨噬细胞和PHT介导的旁分泌机制对心肌梗死后组织修复和心室重塑过程的影响并探讨其可能机制。 方法：1．细胞实验部分：进行Wistar大鼠腹腔巨噬细胞原代培养，并以苯妥英钠对部分体外培养的巨噬细胞进行预刺激(24h)，移植前用荧光染料DAPI标记。 2．动物实验部分：建立Wistar大鼠心肌缺血再灌注模型，成活动物随机分为假手术组(Sham组，12只)，对照组 (AMI组，23只)，苯妥英钠组(PHT组，17只)，单纯巨噬细胞移植组(Mφ组，20只)，以及经苯妥英钠预刺激的巨噬细胞移植组(Mφ-PHT组，16只)。Mφ组和Mφ-PHT组在再灌注同时，向左心室缺血区中心及周边分别以1×10<'5>细胞/只，100μL的剂量多点注射；AMI组和PHT组注射不完全DMEM培养基(100μL)；PHT组从术后第1天开始，连续14天经腹腔注射PHT(75mg/kg/天)。术后第7天，各组分别随机处死部分动物，留取心脏标本，称量双侧心室重量；通过苦味酸-天狼猩红染色测定胶原容积分数(CVF)及膨展指数、梗死面积等，结合环形偏振光分析梗死区胶原成分比例；抗α-SMA免疫荧光染色测定梗死区小动脉密度；抗vWF免疫荧光染色测定梗死区毛细血管密度；抗WGA免疫荧光染色测定非梗死区心肌细胞横截面积(CSA)；梗死区血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2) 蛋白表达水平采用Western blot分析。剩余动物于模型建立后第28天进行有创血流动力学分析，而后处死动物取心脏组织，进行组织病理学分析。 结果：1．细胞实验部分：1)体外培养的巨噬细胞贴壁牛长，培养的细胞群中无分裂相；苯妥英钠刺激后的巨噬细胞仍贴壁良好，生长状况稳定；2)贴壁培养的细胞群中绝大多数细胞呈CD68 阳性。3) DAPI 标记的巨噬细胞，经紫外光激发后呈现大量圆形或不规则型的蓝色荧光。 2．动物实验部分：1)巨噬细胞移植成功的证据：术后1天心肌梗死区组织CD68免疫荧光染色显示DAPI标记的巨噬细胞表达CD68。2)术后第28天血流动力学结果：Mφ-PHT 组术后第 28 天LV+dp/dt<,max>显著高于AMI组；与Mφ组比较，Mφ-PHT组术后第28天LV+dp/dt<,max>亦增高且具有统计学差异。3)心脏重量指标比较：全心室体重比(V/BW)、左室体重比(LV/BW)、右室体重比(RV/BW)在各组间比较无显著差异。4)左室重塑指标结果：与AMI组比较，PHT组、Mφ组和 Mφ-PHT 组术后第7天和第28天膨展指数均显著减少且具有统计学差异；与AMI组比较，Mφ-PHT组术后第28天梗死面积显著减小；与AMI组比较，PHT组术后7天和第28天梗死面积有减小趋势；与Mφ组比较，Mφ-PHT 组术后7天和第28天梗死面积有减小趋势；与AMI组比较，Mφ组和Mφ-PHT 组术后7 天纤维面积显著减小；与AMI组比较，PHT组、Mφ组和Mφ-PHT 组术后第28天纤维面积显著减小；与Mφ组比较，Mφ-PHT 组术后第28天纤维面积显著减小；与AMI组比较，Mφ组和 Mφ-PHT 组术后7天非梗死区CSA显著减小，而PHT组术后7天非梗死区CSA 有减小趋势；与AMI组比较，PHT组、Mφ组和Mφ-PHT组术后第28天非梗死区CSA显著减小。5) 胶原容积分数结果：与AMI组比较，PHT组、Mφ组利Mφ-PHT组术后第7天和第28天梗死区CVF显著增加；与Mφ组比较，Mφ-PHT组术后第7天梗死区CVF显著增加；与AMI组比较，Mφ组和Mφ-PHT组术后第7天和第28天非梗死区CVF显著减少。6)胶原成分比例结果：与AMI组比较，PHT组、Mφ组和Mφ-PHT组术后第7天和第28天梗死区胶原成熟度显著增加；与Mφ组比较，Mφ-PHT 组术后第7天和第28天梗死区胶原成熟度显著增加。7)小动脉密度分析结果：与AMI组比较，PHT 组、Mφ组和Mφ-PHT 组术后第7天和第28天小动脉密度显著增加：与Mφ组比较，Mφ-PHT组术后第7天和第28天小动脉密度有增加趋势。8)毛细血管密度分析结果：与AMI 组比较，PHT组术后第7天和第28天毛细血管密度有增加趋势；与Mφ组比较，Mφ-PHT组术后第7天和第28天毛细血管密度有增加趋势。9)Westernblot 检测结果：与AMI 组比较，Mφ-PHT 组术后第7天梗死区 b-FGF、MMP-2、TIMP-1和 TIMP-2 蛋白表达水平显著增强；与AMI组比较，PHT组和Mφ组术后第7天梗死区MMP-2蛋白表达水平显著降低；与Mφ组比较，Mφ-PHT组术后第7天梗死区 VEGF、b-FGF、MMP-2、TIMP-1和TlMP-2蛋白表达水平显著增强：与Sham组比较，AMI组术后第7天梗死区MMP-2/TIMP-2比值显著增加。 结论：1．苯妥英钠可能通过介导旁分泌机制，加速胶原沉积和成熟，并促进小动脉形成，加速组织修复过程，继而改善心肌梗死后心室重塑；2．心肌梗死区巨噬细胞移植亦可通过上述机制加速组织修复、改善心肌梗死后心室重塑；3．苯妥英钠预刺激的巨噬绌胞可以对心肌梗死后组织修复过程产生明显的协同作用，可能机制为通过旁分泌效应上调多种与组织修复密切相关的生长因子/关键酶系的蛋白表达水平，加速组织修复过程，且改善左室重塑的效应较单纯巨噬细胞移植更为明显，同时显著改善左室收缩功能。

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综述巨噬细胞在组织修复中作用的研究进展

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