吲哚胺2，3双加氧酶诱导调节性T细胞参与肿瘤免疫耐受机制研究

摘要

目的：探讨女性原发乳腺癌患者体内吲哚胺2,3双加氧酶(IDO/INDO)的表达与局部组织中浸润的调节性T细胞(Tregs)之间的联系，并建立稳定表达IDO的CHO细胞株，考察体外IDO对Tregs细胞发生、发育以及凋亡的影响。 方法：选取2007年6月～2007年8月天津医科大学附属肿瘤医院手术治疗女性原发乳腺癌20例，RT-PCR检测IDO在乳腺原发癌组织、癌旁乳腺组织及腋窝引流区淋巴结中的表达，并将上述组织制作为单细胞悬液，流式细胞仪检测组织中浸润的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的比例，分析IDO表达对局部浸润Tregs细胞的影响，免疫组织化学法检测组织中CD4、IDO及Foxp3表达，进一步观察在乳腺癌患者中IDO与Tregs细胞的相互联系。调取INDO基因编码序列(CDS)区域，克隆至pMD19-Tsimple载体中并测序后连入真核表达载体pIRES2-EGFP。将IDO真核表达载体pIRES2-EGFP-IDO转染中国仓鼠卵巢细胞CHO，建立稳定表达IDO的CHO细胞株，PCR及RT-PCR检测INDO基因的整合与转录，Westernblot检测IDO蛋白的表达，氨基酸分析仪检测IDO蛋白的活性。分选并纯化人乳腺癌患者外周血CD3+T细胞，将其与转染IDO的CHO细胞共孵育，以转染空质粒组为对照。AnnexinV-FITC和PI双染色流式细胞法检测T细胞的凋亡。流式细胞法检测CD4+CD25+CD127-调节性T细胞比例变化，半定量及实时荧光定量RT-PCR检测共培养后Foxp3基因表达变化，Westernblot检测Foxp3蛋白表达。 结果：半定量RT-PCR结果显示，乳腺癌患者腋窝引流区淋巴结组织中IDO表达水平高于乳腺原发癌组织，癌旁乳腺组织中IDO表达量最低，有统计学意义(P<0.05)。淋巴结、原发癌和癌旁乳腺组织中浸润的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞比例分别为(4.40±2.91)％、(2.62±2.14)％、(2.01±1.49)％，淋巴结组织中浸润的Tregs细胞比例最高，有统计学差异(P<0.05)。免疫组织化学法检测组织中IDO表达阳性细胞指数与Foxp3表达阳性细胞指数之间呈现线性相关(P<0.05)。IDO真核表达载体经酶切鉴定表明片段插入到载体pIRES2-EGFP中，证实质粒连接成功。稳定表达INDO基因的CHO细胞具有外源目的基因的整合和相应mRNA的转录，Westernblot检测示其高表达IDO蛋白，氨基酸分析显示该蛋白可降解培养上清中的色氨酸，产生犬尿氨酸，具有功能活性。乳腺癌患者外周血CD3+T细胞与稳定表达IDO的CHO细胞共孵育72小时后，出现了明显的细胞凋亡，凋亡率为(79.07±8.13)％，而pIRES2-EGFP转染组和正常CD3+T细胞组的凋亡率分别为(59.80±11.46)％和(32.4±6.40)％，组间比较有统计学差异(P<0.05)。共孵育7天后，IDO转染CHO细胞组中CD4+CD25+CD127T细胞占CD4+T细胞的比例为(8.98±1.88)％，而pIRES2-EGFP转染组为(3.73±1.12)％，两组之间有统计学差异(P<0.05)；半定量RT-PCR结果示前者Foxp3的表达明显高于后者，实时荧光定量RT-PCR结果亦显示前者Foxp3的相对表达量高于后者(0.00056±0.00012比0.00023±0.00005)，IDO转染CHO细胞组Foxp3蛋白/β-actin的比值为(0.0450±0.0025)，结果显示实验组Foxp3mRNA的转录及蛋白的表达均高于对照组，具有统计学差异(P<0.05)。 结论：第一，IDO的抑制作用与Tregs细胞在乳腺癌患者体内存在着密切联系，局部组织中IDO的高表达常同时伴有Tregs细胞的浸润。第二，成功构建了IDO的真核表达载体pIRES2-EGFP-IDO，并建立了稳定表达IDO的CHO细胞株，IDO的活性表达可导致微环境中色氨酸耗竭，并产生其分解代谢产物，如犬尿氨酸等衍生物。第三，发现IDO影响了T细胞的增殖过程，并诱导了T细胞凋亡。证明IDO介导的肿瘤诱导免疫耐受机制中至少包括IDO活性表达导致的T细胞凋亡过程。第四，证实IDO可以在体外诱导Tregs细胞的生成。表明IDO能促进CD3+T细胞中具有分化潜能的细胞向Tregs细胞发生分化。IDO诱导的Tregs细胞的发生发育过程联合参与了IDO参与的众多免疫耐受反应。总之，本研究探讨了IDO和Tregs细胞在体内外的相互联系与作用。结果表明，IDO与Tregs细胞在肿瘤患者体内联系密切。体外实验表明IDO参与肿瘤免疫耐受的机制应包括IDO介导的色氨酸耗竭及其代谢产物的毒性作用、致T细胞凋亡作用和通过影响Tregs细胞的发生发育而诱导其生成三个方面。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1材料、试剂与仪器

2实验方法

3结果

3.1 IDO 在乳腺癌患者不同组织中表达情况

3.2组织中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的浸润情况

3.3免疫组织化学法检测组织中CD4、IDI及Foxp3

3.4细胞系INDO表达强弱的筛选

3.5 INDO编码序列的构建与鉴定

3.6 IDO真核表达载体的鉴定

3.7 INDO基因在CHO细胞中的转录

3.8 稳定表达IDO的CHO细胞株的建立与鉴定

3.9 IDO转染CHO细胞对CD3+T细胞凋亡的影响

3.10 IDO对Tregs细胞的体外诱导实验

4讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 吲哚胺2,3双加氧酶与肿瘤免疫耐受的研究进展

致谢