热休克蛋白90抑制剂对未分化甲状腺癌增殖及摄碘动力学的影响

摘要

背景与目的：
　　 未分化甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）恶性程度很高，预后极差，早期即可发生周围组织浸润和远处转移，且进展迅速，外照射治疗虽可暂时缓解但极易复发，经典的化疗方案收效甚微。研究发现，在体内作为分子伴侣的热休克蛋白90（heat shock protein90，HSP90）对肿瘤的发生发展起着重要作用，正逐渐成为肿瘤治疗的新靶点。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-Allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG）是一种特异性的HSP90抑制剂，在体内可阻断肿瘤赖以生存的信号通路网络。本研究旨在通过体外细胞培养的方法，探讨17-AAG对人ATC细胞增殖及凋亡等的影响，并分析其可能的作用机制。
　　 钠碘转运体（sodium/iodide symporter，NIS）位于甲状腺滤泡细胞膜上，其功能是促进碘的主动转运。将NIS全长DNA转染入ATC细胞后可诱导NIS的表达增高，进而促进肿瘤细胞对碘的摄取。但由于肿瘤细胞摄取的碘不能进行有机化，导致细胞内碘迅速外流。本研究的目的是了解17-AAG对已转染NIS基因的ATC细胞摄碘动力学的影响，为这一基因工程与核素治疗相结合的方案将来逐渐过渡到临床应用提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.对人ATC细胞系FRO进行常规培养和传代。在96孔板中加入不同浓度梯度（0.1～10μM）的17-AAG，分别继续培养24、48及72h后，MTT法检测各浓度组细胞在不同时间点的生长抑制率。
　　 2.收集分别经0.1μM、1μM和10μM的17-AAG作用后继续培养48h的FRO细胞，PI进行DNA染色，流式细胞仪检测各期细胞的比例；Anncxin-V-FITC及PI双重染色，流式细胞仪检测凋亡细胞所占的比例，计算凋亡率。
　　 3.提取经1μM的17-AAG作用48h后的FRO细胞的总蛋白，Western-blot检测17-AAG作用前后FRO细胞内HSP90、癌蛋白pAkt、Raf-1等表达的变化。
　　 4.碱裂解法提取已构建好的重组质粒pcDNA3.1-hNIS，并用限制性内切酶法对其进行鉴定。
　　 5.脂质体转染法将质粒转染入FRO细胞中，转染后24h通过瞬时摄125Ⅰ能力的测定初步验证转染效率。
　　 6.G418抗性筛选以获得稳定表达细胞系hNIS-FRO。
　　 7.往hNIS-FRO细胞的培养基中引入125Ⅰ，进行125Ⅰ内流及外流的系列实验，绘制时间.放射性曲线；并与未转染组进行对比。
　　 8.分析经1μM的17-AAG作用24h后hNIS-FRO细胞125Ⅰ内流及外流的变化，并与未经药物治疗的对照组进行对比研究。
　　 结果：
　　 1.经不同浓度的17-AAG作用24、48及72h后，细胞生长抑制率呈量效及时效依赖性。0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μM的17-AAG作用72h后的细胞生长抑制率分别为35.9％、40.8％、54.2％、63.9％、68.3％、73.6％和78.1％。
　　 2.经17-AAG作用48h后，随着药物浓度增大，G0/G1期细胞明显增多，S期和G2/M期细胞逐渐减少，细胞周期阻滞效应呈剂量依赖性：对照组以及经0.1、1、10μM的17-AAG作用48h的各治疗组间的细胞凋亡率存在明显差异。
　　 3.与对照组相比，经1μM的17-AAG作用48h后的FRO细胞HSP90表达上调，癌蛋白pAkt、Raf-1等表达明显下调。
　　 4.重组质粒的酶切产物在5502bp和1922bp处形成两条清晰条带，可以证实本实验所提取质粒确实为pcDNA3.1-hNIS。
　　 5.pcDNA3.1-hNIS转染FRO细胞后24h，瞬时摄125Ⅰ能力约为对照组的2.53倍。
　　 6.G418抗性的筛选浓度最终确定为700μg/ml。未转染组的FRO细胞完全没有G418抗性。
　　 7.往hNIS-FRO细胞的培养基中引入125Ⅰ后，摄125Ⅰ能力较对照组明显提高，60min时的125Ⅰ摄取率约为对照组的11.54倍；但当孵育环境中的125Ⅰ去除后，125Ⅰ则快速外流，30min后hNIS-FRO细胞内的125Ⅰ滞留率仅为初始的9.32％。
　　 8.1μM的17-AAG作用于hNIS-FRO细胞后24h，我们往培养液中加入125Ⅰ，在20～60min的时间段内，药物作用组的hNIS-FRO细胞摄125Ⅰ能力较对照组有了不同程度的提高；当撤掉环境中的125Ⅰ后0～30min，药物作用组的hNIS-FRO细胞内的125Ⅰ滞留率均较对照组明显增加，125Ⅰ的外流减少，30min后17-AAG作用组的细胞内125Ⅰ滞留率为32.69％，是对照组的3.51倍。
　　 结论：
　　 1.17-AAG可明显抑制ATC细胞的增殖，且这种抑制作用呈量效及时效依赖性。
　　 2.17-AAG作用后，G0/G1期的ATC细胞明显增多，细胞凋亡率增加，也呈量效依赖性。证实17-AAG不仅可有效抑制肿瘤细胞增殖，还可诱导细胞凋亡。
　　 3.17-AAG作用后HSP90表达上调，癌蛋白pAkt、Raf-1等表达下调。证实17-AAG的肿瘤细胞增殖抑制作用可能与细胞周期阻滞于G0/G1期以及阻断肿瘤内的信号通路等有关。
　　 4.将NIS转染入ATC细胞后可获得稳定表达细胞系，其摄碘能力大大提高，而且这种摄碘能力完全是由NIS基因表达后介导的：此方法尚不能克服肿瘤细胞内摄取的碘迅速外流的缺陷。
　　 5.把NIS转染入ATC细胞后获得的稳定表达细胞系在经一定浓度的17-AAG作用后，还可进一步提高肿瘤细胞的摄碘率，而且更为关键的是可以明显延迟碘的外流，提高细胞内碘的滞留率。