尿道致病性大肠杆菌fimA基因的克隆与表达

摘要

[目的]
　　 泌尿道感染是临床常见病，造成泌尿道感染的大肠杆菌被称为尿道致病性大肠杆菌(UPEC)。Ⅰ型菌毛是UPEC主要毒力因子之一。本文对UPEC132编码Ⅰ型菌毛结构基因的fimA进行克隆与表达，并制备抗血清，为今后的研究工作提供帮助。
　　 [方法]
　　 1.采用甘露糖敏感血凝(MSHA)和fimA PCR进行Ⅰ型菌毛的表型和基因型检测。
　　 2.PCR扩增UPEC132fimA全基因，采用T-A克隆fimA，进行测序。然后对其和pET32a分别用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切，T4连接酶连接构建重组质粒pET32a-fimA。采用PCR和双酶切鉴定。
　　 3.将pET32a-fimA转入表达宿主E.coli BL21(DE3)，构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-fimA。重组菌经0.5mM IPTG30℃诱导表达4h，超声裂解，离心分离上清与沉淀，分别进行SDS-PAGE分析。
　　 4.采用镍亲和层析法分离纯化E.coli BL21(DE3)/pET32a-fimA的诱导表达产物，获得纯化的FimA重组蛋白。经透析复性后，FimA重组蛋白进行SDS-PAGE检测及分析重组蛋白的纯度和浓度。
　　 5.用FimA纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备抗血清。采用间接ELISA法测定抗血清效价，Western blot法检测血清抗体特异性。
　　 6.以UPEC132全菌悬液作为包被抗原，以制备的FimA多克隆抗血清作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，建立全菌ELISA方法，进行Ⅰ型菌毛的检测。
　　 [结果]
　　 1.UPEC132 MSHA结果阴性，fimA PCR阳性，表明该菌具有Ⅰ型菌毛的编码基因，但不表达Ⅰ型菌毛。
　　 2.成功构建重组质粒pET32a-fimA，经PCR鉴定和测序分析，并与GenBank数据库中的fimA基因(注册号：1037247)进行序列比对，相似性100％。
　　 3.重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-fimA经IPTG诱导表达，菌液离心后的上清进行SDS-PAGE，显示不含FimA重组蛋白。菌液离心后的沉淀经超声裂解后离心，取沉淀进行SDS-PAGE，显示重组蛋白占菌体总蛋白的37％。
　　 4.采用镍亲和层析获得纯化的FimA重组蛋白，经SDS-PAGE和凝胶成像系统分析，纯化蛋白的分子量为39.93kD，蛋白纯度为95.6％，浓度为5.87mg/mL。
　　 5.用纯化FimA重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清，ELISA测得血清效价≥1:51200，Western blot显示为单一条带。
　　 6.全菌ELISA结果显示，待检菌株与1:400的FimA抗血清反应，阴性对照E.coli k12 p678-54、阳性对照E.coli136和UPEC132的S/N值分别为1.12、6.27和1.34。UPEC132全菌ELISA的结果为阴性，与MSHA相一致。
　　 [结论]
　　 本论文成功地克隆了UPEC132 fimA的全基因，构建了重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET32a-fimA，重组蛋白的表达量为37％；获得FimA纯化蛋白，制备了多克隆抗体，具有很好的特异性；为UPEC致病性的深入研究奠定基础。