乳腺癌保乳手术切缘中IDO、Tregs及CD105的检测与临床预后分析

摘要

目的：研究保乳术在年轻乳腺癌患者(≤35岁)中的临床治疗效果并分析其预后影响因素。检测保乳术中癌及切缘组织中吲哚胺2，3-双加氧酶(Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)的表达情况，同时检测调节性T细胞(Tregs，RegulatoryT cells)和CD105的表达，分析保乳术切缘的免疫微环境状态，研究IDO对保乳患者预后的影响。体外实验进一步验证IDO、T细胞及微血管密度(MVD)对肿瘤转移的作用，从而探讨保乳患者切缘免疫微环境状态的临床意义。
　　 方法：
　　 1.回顾性分析天津医科大学附属肿瘤医院1995.1～2006.12行保乳手术的年轻乳腺癌患者71例及同期行改良根治术的70例患者的临床病理资料，比较两组的生存情况，并分析影响年轻乳腺癌患者保乳术预后的因素。
　　 2.免疫组织化学法检测保乳术癌、切缘及正常乳腺组织中IDO、Tregs及CD105的表达情况，分析IDO与Fregs、CD105的关系，观察保乳术切缘的免疫微环境状态，分析IDO表达与年轻保乳术患者预后的相关性。
　　 3.通过基因转染建立高表达IDO的中国仓鼠卵巢细胞CHO，半定量RT-PCR和Western blot检测转染后的CHO中IDO的表达；流式细胞仪检测转染后的CHO细胞对乳腺癌患者外周血CD3+T细胞的凋亡；利用Transwell小室，检测IDO对HUVEC成管能力的影响；动物实验中检测未转移和转移小鼠乳腺癌组织中IDO的表达情况，流式细胞仪检测癌组织中浸润的CD4+CD25+CD127-T细胞的比例。
　　 结果：
　　 1.年轻乳腺癌患者保乳术后随访5年，发现局部复发5例，远处转移8例，死亡7例，3年、5年无瘤生存率分别为94.4％、78.9％，总生存率90.1％；接受乳腺癌改良根治术的患者中，局部复发3例，远处转移6例，死亡5例，3年、5年无瘤生存率分别为95.7％、82.9％，总生存率92.9％；接受两种不同手术方式的年轻乳腺癌患者预后未发现统计学差异(P均>0.05)。
　　 2.对年轻乳腺癌保乳患者进行预后相关因素分析，切缘阳性与局部控制率、无病生存率、总生存率相关(P均<0.05)；淋巴结转移与无病生存率、总生存率相关(P均<0.05)。
　　 3.癌组织中IDO、Foxp3及CD105三者表达均高于保乳术切缘及正常乳腺组织，并具有明显的统计学差异(P均<0.05)，在切缘组织中三者表达也均高于正常乳腺组织，但无明显统计学差异(P>0.05)。
　　 4.乳腺癌中IDO的表达与Tregs及MVD-CD105的表达正相关；保乳术切缘组织中IDO的表达与Tregs的分布也呈正性相关，而与CD105表达无相关性。
　　 5.乳腺癌中IDO阳性组的总生存率低于IDO阴性组，且IDO阳性组中发生远处转移的患者高于IDO阴性组(P均<0.05)；切缘组织IDO阳性组的5年无瘤生存率及总生存率均低于IDO阴性组，IDO阳性组中发生远处转移的患者高于IDO阴性组，但无统计学差异(P>0.05)。
　　 6.利用IDO抑制剂1-MT进行细胞学实验，发现IDO可以促进HUVEC形成管样结构的数量。
　　 7.CD3+T细胞与稳定表达IDO的CHO共孵育72小时后，出现了明显的细胞凋亡，凋亡率为(79.07±8.13)％，而pIRES2-EGFP转染组和正常CD3+T细胞组的凋亡率分别为(59.80±11.46)％和(32.40±6.40)％，组间比较有统计学差异(P<0.05)。
　　 8.免疫组化示发生转移小鼠乳腺癌原发癌[(12.40±5.15)％]和转移癌中[(14.28±6.46)％]IDO的阳性细胞指数均高于未发生转移小鼠乳腺癌组织[(3.16±1.63)％](P<0.05)，流式检测显示转移小鼠乳腺原发癌[(4.70±1.10)％]和转移癌[(5.10±1.18)％]中CD4+CD25+CD127-T细胞的比例均高于未发生转移小鼠乳腺癌[(2.27±0.83)％](P<0.05)，小鼠乳腺癌组织中(原发癌和转移癌)IDO的阳性细胞指数与浸润的 CD4+CD25+CD127-T细胞的比例间正性相关(r2=0.475，P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.年轻乳腺癌患者保乳术与根治术预后无明显差异，提示年龄并不是选择手术方式的依据。切缘状态、腋窝淋巴结转移是影响年轻乳腺癌患者预后的重要因素，切缘病理阴性并不能准确完整评估保乳术后复发及转移的风险，需要寻找更多的分子病理学指标来作为临床的参考。
　　 2.乳腺癌组织中IDO蛋白表达水平与肿瘤的临床分期和腋窝淋巴结转移密切相关(P<0.05)；癌组织中IDO阳性组的5年无瘤生存率及总生存率低于IDO阴性组，切缘组织IDO阳性组的5年无瘤生存率及总生存率均低于IDO阴性组，且IDO阳性组中发生远处转移的患者高于IDO阴性组，提示IDO的阳性表达可能与乳腺癌的进展和转移相关。
　　 3.癌组织中IDO、Foxp3及CD105三者表达均高于保乳术切缘及正常乳腺组织，并具有明显的统计学差异，在切缘组织中三者表达也均高于正常乳腺组织，由此推断距离肿瘤不同范围的组织免疫状态可能不同。
　　 4.乳腺癌中IDO的表达与Tregs及MVD-CD105的表达正相关；保乳术切缘组织中IDO的表达与Tregs的分布也呈正性相关，提示乳腺癌局部的IDO表达可能与Tregs分化及血管形成有关。
　　 5.体外实验发现IDO可以促进HUVEC形成管样结构、影响T细胞的增殖并诱导其凋亡，证明IDO介导的肿瘤诱导免疫耐受机制中可能包括了加速新生血管形成和导致T细胞的凋亡。
　　 6.转移的小鼠乳腺原发癌和转移癌中IDO的表达水平和Tregs的比例均高于未转移的癌组织中，且IDO的表达水平与浸润的Tregs的比例间正性相关，进一步验证了IDO可能通过诱导Tregs分化而促进肿瘤转移。
　　 总之，本研究首先分析了年轻乳腺癌患者保乳术的预后影响因素，提出切缘免疫状态可能对评估患者预后及建立个体化的随访手段有一定的临床价值，详细分析了保乳手术标本中IDO、Tregs及CD105的表达及相互关系，体外实验和动物实验进一步验证我们的推断。结果表明，IDO可能通过促进新生血管形成、导致T细胞凋亡和诱导Tregs细胞的分化等多个途径影响了肿瘤局部的免疫微环境进而影响了乳腺癌患者的预后，从而揭示了研究保乳术切缘的免疫状态对临床工作的参考价值。