叶酸调控神经干细胞增殖分化和凋亡对脑梗死大鼠的神经保护作用机制研究

摘要

目的：
　　 1.通过建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型和体外缺氧神经干细胞(neural stem cells，NSCs)损伤模型，免疫荧光双标记检测NSCs增殖分化，观察叶酸对缺血缺氧损伤NSCs增殖分化的影响，明确叶酸能否通过促进NSCs增殖分化对脑梗死大鼠产生神经保护作用。
　　 2.通过检测Notch信号通路和ERK信号通路相关基因mRNA和蛋白表达，在抑制ERK通路条件下进一步观察NSCs增殖分化，探讨叶酸对缺血缺氧损伤NSCs增殖分化调控机制。
　　 3.通过凋亡率及凋亡基因芯片和线粒体凋亡途径相关蛋白表达检测，观察叶酸对缺氧损伤NSCs凋亡的影响，探讨叶酸对NSCs凋亡调控的可能机制，为研究叶酸对缺血缺氧性脑损伤的防治提供科学依据。
　　 方法：
　　 1.SD大鼠随机分为假手术组(Sham-OP)、中动脉栓塞组(MCAO)、中动脉栓塞+叶酸低剂量组(MCAO+LFA)和中动脉栓塞+叶酸高剂量组(MCAO+HFA)。栓线法制备大鼠MCAO模型，Sham-OP组和MCAO组以生理盐水10ml/kg·bw·d灌胃，MCAO+LFA组和MCAO+HFA组以叶酸溶液4mg/kg·bw·d和12mg/kg·bw·d灌胃，干预28d后制备MCAO模型，进行神经功能评分和脑组织含水量检测，氯化四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积百分比，测定血清叶酸和同型半胱氨酸(Hcy)含量变化，TUNEL法检测神经细胞凋亡率，HE染色观察脑组织病理改变，Y迷宫检测各组学习记忆能力，免疫荧光双标记检测脑组织内源性NSCs增殖分化，Western blot测定脑组织β-Tubulin-Ⅲ蛋白表达。原位杂交检测脑组织在梗死后不同时间点Notch1、Hes1/5、Mash1、Ngn1/2基因mRNA表达，Westernblot检测梗死侧脑组织Notch1、Hes1/5以及pERK1/2蛋白表达。U0126阻断ERK通路后，再次检测内源性NSCs增殖和pERK1/2蛋白表达。
　　 2.体外培养新生SD大鼠NSCs，细胞分为正常对照组(Control)，缺氧损伤组(Hypoxia)，缺氧叶酸低剂量组(Hypoxia+FA-L)，缺氧叶酸高剂量组(Hypoxia+FA-H)和缺氧叶酸缺乏组(Hypoxia+FA-D)。各组叶酸终浓度分别为4μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、44μg/ml和0.65μg/ml，在1％O2中缺氧损伤8h。MTT法检测细胞活力，增殖第6d以免疫组化双标记法检测NSCs增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡率，分化第6d以Western blot检测GFAP和β-Tubulin-Ⅲ蛋白。实时定量PCR检测细胞增殖和分化期 Notch1、Hes1/5、Mash1、Ngn1/2以及ERK1/2基因mRNA表达，Western blot检测Notch1、Hes1/5和pERK1/2蛋白表达。U0126阻断ERK通路后检测NSCs增殖和pERK1/2蛋白表达。凋亡基因芯片检测Hypoxia和Hypoxia+FA-H组NSCs凋亡相关基因表达差异，Western blot检测各组NSCs的细胞色素C(Cyt C)、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3/9蛋白表达，检测各组培养基Hcy浓度。
　　 结果：
　　 1.叶酸对脑梗死大鼠内源性NSCs和体外缺氧NSCs增殖分化的影响：叶酸补充可升高大鼠血清叶酸浓度，降低其血浆Hcy水平，叶酸干预组大鼠神经功能损伤程度和脑梗死体积小于MCAO组，学习记忆能力高于MCAO组，MCAO+HFA组大鼠脑组织含水量和神经细胞凋亡率低于MCAO(P<0.05)。各组大鼠内源性NSCs增殖能力在脑梗死后7d达到高峰，MCAO+HFA组大鼠脑组织BrdU+Nestin+细胞数量高于其他各组(P<0.05)。各组大鼠脑组织BrdU+GFAP+细胞和BrdU+NeuN+细胞数量在脑梗死后14d达到高峰，MCAO+HFA组高于其他各组(P<0.05)，同时叶酸干预组脑组织β-Tubulin-Ⅲ蛋白表达高于MCAO组(P<0.05)。体外实验中，缺氧损伤后，两叶酸添加组细胞活力高于Hypoxia组，Hypoxia+FA-D组细胞活力低于Hypoxia组(P<0.05)。增殖第6d，两叶酸添加组BrdU+Nestin+细胞率高于Hypoxia组，且Hypoxia+FA-H组高于Hypoxia+FA-L组；而Hypoxia+FA-D组BrdU+Nestin+细胞率则低于Hypoxia组(P<0.05)。分化第6d，Hypoxia+FA-H组GFAP蛋白表达高于Hypoxia组，β-tubulin-Ⅲ蛋白表达低于Hypoxia组，Hypoxia+FA-D组该两种蛋白表达均低于其他各组(P<0.05)。
　　 2.叶酸对脑梗死大鼠脑组织和体外缺氧NSCs Notch和ERK信号通路相关基因表达的影响：大鼠脑梗死后7d，MCAO+HFA组Notch1、Hes1/5 mRNA和蛋白表达高于其他各组，两叶酸干预组Mash1 mRNA表达低于MCAO组(P<0.05)，MCAO+HFA组Ngn1/2 mRNA表达强度低于其他各组(P<0.05)。体外实验中，无论增殖期还是分化期，Notch1、Hes1/5mRNA和蛋白在Hypoxia+FA-H组表达量最高，在Hypoxia+FA-D组表达量最低(P<0.05)。Mash1、Ngn1/2 mRNA在Hypoxia+FA-H组表达量最低(P<0.05)。大鼠脑梗死后7d，MCAO+LFA组和MCAO+HFA组 pERK1/2蛋白表达高于MCAO组(P<0.05)。U0126阻断ERK通路后，可以降低叶酸干预组pERK1/2蛋白的高表达和脑组织 BrdU+Nestin+细胞数(P<0.05)。体外实验中，Hypoxia+FA-L组和Hypoxia+FA-H组在增殖期pERK1/2蛋白表达高于Hypoxia组和Hypoxia+FA-D组(P<0.05)。U0126阻断ERK通路可降低叶酸干预组的细胞活力和BrdU+Nestin+细胞率，同时抑制pERK1/2蛋白表达(P<0.05)。
　　 3.叶酸对体外缺氧NSCs凋亡的影响和线粒体凋亡途径的作用：增殖第6d，Hypoxia组细胞凋亡率高于Control组、Hypoxia+FA-L组和Hypoxia+FA-H组，而低于Hypoxia+FA-D组(P<0.05)。Hypoxia+FA-H组与Hypoxia组相比，表达上调的基因有bcl2和Hprt1，下调的基因有p53、apaf-1、bax以及caspase-3/9。Western blot检测结果显示Cyt C、Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达量在两叶酸添加组均低于Hypoxia组，Hypoxia+FA-D组高于Hypoxia组；Bcl-2蛋白在两叶酸添加组均高于Hypoxia组，Hypoxia+FA-D组低于Hypoxia组(P<0.05)。
　　 结论：叶酸对脑梗死大鼠的神经保护作用与促进其内源性NSCs增殖有关，体外实验证明叶酸对缺氧损伤NSCs的增殖和向星形胶质细胞细胞分化有促进作用，对体外缺氧NSCs向神经元分化有一定抑制作用，叶酸缺乏则抑制缺血缺氧环境中NSCs的增殖分化。Notch信号通路和ERK信号通路在叶酸对NSCs增殖分化影响中起重要作用，而叶酸对体外缺氧NSCs凋亡的抑制作用与线粒体途径有关。