rhIGF-1对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节作用

摘要

目的：
　　 在成骨细胞(ostelblast，OB)及破骨细胞(Osteoclast，OC)的表面均表达有胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor1，IGF-I)的受体，IGF-I对这两种细胞也都具有激活作用。IGF-1在调节骨代谢平衡中具有重要作用，被认为是存在于RANKL/OPG系统之上，调节成骨细胞与破骨细胞相互作用的核心分子。
　　 为此，本文拟探讨不同浓度的rhIGF-I对成骨细胞和破骨细胞的直接作用，及对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节。
　　 方法：
　　 1.利用50ng/ml的RANKL诱导小鼠破骨前体细胞系分化为成熟破骨细胞。TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)鉴定。
　　 2.以50ng/ml rhIGF-I分别干预成细胞以及分化成熟的破骨细胞，干预时间分别为：6min、20min、60min；Western-blotting检测rhIGF-1R活化情况。
　　 3.分别加入0、2、4、6ug/ml的兔抗rhIGF-I IgG中和培养基中的rhIGF-I，利用Western-blotting进行抗体中和浓度的筛选。
　　 4.重新接种成骨细胞和破骨细胞，用0、10、50、100ng/ml的rhIGF-1分别干预成骨细胞、破骨细胞，12小时后终止培养并收集培基，之后实验分为三组：A组：rhIGF-1直接干预组。B组：条件培养基交互培养组：破骨细胞经rhIGF-1干预后的条件培养基(OC conditioned medium after rhIGF-1 treatment，OCCM)；成骨细胞经rhIGF-1干预后的条件培养基(OB conditioned medium after rhIGF-1treatment，OBCM)。滤过OCCM、OBCM后两细胞培基互换交互培养12h。C组：rhIGF-1中和后交互培养组：OCCM、OBCM中加入4ug/ml的抗rhIGF-I IgG，中和后再用于交互培养12h。
　　 (1)ELISA检测各组OB上清液中RANKL、OPG及BGP含量。
　　 (2)实时荧光定量PCR检测各组OB中Bgp、Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平。
　　 结果：
　　 1.50ng/ml的RANKL诱导培养8天后，RAW264.7出现TRAP阳性多核细胞。
　　 2.50ng/ml rhIGF-1分别干预成骨细胞、破骨细胞6、20、60min后，Western-blotting检测随着rhIGF-1干预时间的延长磷酸化rhIGF-1R的量逐渐增加，而未磷酸化rhIGF-1R逐渐减少。
　　 3.未加rhIGF-1干预空白对照组无磷酸化rhIGF-1R；rhIGF-1干预后可以检测到大量磷酸化rhIGF-1R；rhIGF-1干预后培基中加入2ug/ml抗体中和后可检测到少量磷酸化rhIGF-1R，而加入4、6ug/ml的抗体中和后未检测到磷酸化rhIGF-1R。同时随着中和抗体浓度的增加，非磷酸化IGF-IR也增加。
　　 4.(1)当rhIGF-1单独干预成骨细胞时，测定上清液中RANKL、OPG及BGP含量，结果显示不同浓度的IGF-1对成骨细胞合成RANKL、OPG及BGP无影响；而当用OCCM及抗体中和后的OCCM培养成骨细胞时，发现三种细胞因子在上清液中的含量均在rhIGF-1初始干预浓度为10、50ng/mL时明显高于其他组，并以低剂量组--即rhIGF-1初始浓度为10ng/mL时最高。同时，当用抗体中和后的OCCM培养成骨细胞时，三种细胞因子在上清液中的表达在低剂量组明显高于OCCM培养的成骨细胞组。
　　 (2)实时荧光定量PCR检测结果显示rhIGF-1直接干预OB、OC时，OB中Bgp，Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平在不同剂量组与未加rhIGF-1干预的空白组之间无明显差别；而OCCM与抗体中和后OCCM培养的OB组及OBCM与抗体中和后OBCM培养的OC在rhIGF-1干预浓度为10ng/ml时Bgp、Opg、Rankl及Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平显著高于空白组与其他剂量组，统计学分析表明前者与其它各组表达水平存在显著差异(p<0.05)。
　　 结论：
　　 综合上述各项指标的检测结果显示，rhIGF-1直接干预成、破骨细胞时作用不明显；当有另一细胞参与后，各项检测指标的变化均非常显著，以低剂量组最为明显，但不是剂量依赖性。鉴于rhIGF-1已经被证实有显著的体内促成骨活性，因此本研究推测rhIGF-1在对成骨细胞的刺激上可能首先作用于破骨细胞，引起破骨细胞及其活动微环境的改变，进而影响到成骨细胞的生长和功能；同理对破骨细胞也是一样，要先作用于成骨细胞引起成骨细胞及其活动微环境的改变，进而影响到破骨细胞的生长和功能。