真核表达质粒pSG5-Oct4的构建及瞬时表达的研究

摘要

目的：
　　 人胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)具有无限增殖、自我更新及多向分化的潜能，这也使得ES细胞成为了基础研究和临床应用的种子细胞。干细胞广泛应用的前提是明确其自我更新和定向分化的调控机制，ES细胞多能性作用的维持与其内部一些重要的转录因子的共表达及某些外源性信号分子的作用密不可分。尤其自2006年以来，诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)所揭起的生命科学与医学界干细胞研究的又一个热潮，更是证明了Oct4、Sox2、Nanog等多个转录因子的核心调控作用。其中，Oct4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，Oct4的作用体现在维持种系的持续性及各组织器官分化的精密调节上，同时它也是体外建立iPS的关键基因，但目前对于Oct4的具体作用机制并未完全明确。
　　 胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenchymal stem cells，fBMSCs)是胎儿骨髓中一种具有高度可塑性的细胞，较成人骨髓间充质干细胞发育上更原始，fBMSCs具备良好的增殖能力，及其向三个胚层起源细胞分化的“类胚胎干细胞”的生物学特征。fBMSCs在不同的诱导环境下可向多种成熟体细胞分化细胞，比如，骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、胰岛细胞等。同时，fBMSCs可表达人ES细胞的遗传标志Oct4，且fBMSCs中表达的Oct4的功能与人ES细胞中表达的Oct4的功能相似。由于人ES细胞来源有限，培养成本昂贵，本研究选择以人胎儿骨髓作为Oct4基因的克隆来源，以穿梭质粒pSG5为载体，构建真核表达质粒pSG5-Oct4，检测Oct4基因在胎儿胰岛间质细胞中的表达情况，并尝试pSG5-Oct4转染fBMSCs，探讨其是否对fBMSCs的生长状态及细胞内部结构产生影响，并为后续实验提供据。
　　 方法：
　　 1、采取密度梯度离心的方法，从3～5月人工流产胎儿骨髓中分离出单核细胞，用于总RNA的提取。
　　 2、根据穿梭质粒pSG5上的酶切位点，应用Primer5.0引物设计软件设计人Oct4(NM_002701.4)上下游引物，通过RT-PCR技术扩增Oct4的开放性阅读框。
　　 3、在T4连接酶的作用下，将分别双酶切后pSG5和Oct4基因连接起来，经阳性克隆筛选、双酶切及测序分析鉴定，确保真核表达质粒pSG5-Oct4构建成功。
　　 4、采用组织块法贴壁法原代培养胎儿胰岛间质细胞，倒置显微镜观察胎儿胰岛间质细胞形态及生长状况，选择P2～P3的细胞转染备用。
　　 5、pSG5-Oct4转染胎儿胰岛间质细胞，以转染pSG5和未转染的胰岛间质细胞为对照组，倒置显微镜下观察胰岛间质细胞生长状况及形态学是否发生变化。
　　 6、利用RT-PCR技术从mRNA水平检测真核表达质粒pSG5-Oct4在胎儿胰岛间质细胞中表达否；免疫细胞化学检测Oct4蛋白的表达位置。
　　 7、尝试真核表达质粒pSG5-Oct4转染fBMSCs，观察过表达Oct4的fBMSCs的形态学变化，并利用免疫细胞化学验证。
　　 结果：
　　 1、经RT-PCR反应，凝胶电泳见1.1kb处单一亮带，与预计大小相符合。
　　 2、经RT-PCR克隆得到的Oct4基因的与Genbank数据库中报道的人Oct4基因的同源性达到97％。
　　 3、24h后原代培养的胎儿胰岛间质细胞组织块周围即有细胞晕形成，呈长梭形，约4d见较多的细胞游离出，汇集成束，9d左右细胞铺满瓶底，0.25％胰蛋白酶消化传代。
　　 4、pSG5-Oct4转染胎儿胰岛间质细胞后第3天，细胞生长状态良好，逐渐变圆，转变为悬浮细胞，第6天起大部分细胞变为悬浮细胞，细胞边界清楚，部分细胞呈团块状；而对照组的细胞均未见类似变化，仍为贴壁梭形细胞。
　　 5、经RT-PCR反应后，凝胶电泳见受pSG5-Oct4转染的细胞分别在1.8kb和1.2kb左右有亮带，与预计相符；转变的悬浮细胞经Oct4免疫细胞化学染色阳性。
　　 6、pSG5-Oct4转染fBMSCs，约4周见部分fBMSCs的形态出现了神经元样变化，神经细胞特异性标记NSE免疫细胞化学染色阳性。
　　 结论：
　　 1、本实验成功分离并培养了胎儿胰岛间质细胞及fBMSCs。
　　 2、应用基因重组技术成功构建并鉴定了pSG5-Oct4真核表达质粒。
　　 3、构建成功的pSG5-Oct4真核表达质粒可在胎儿胰岛间质细胞中瞬时表达。
　　 4、fBMSCs中过表达Oct4可能将fBMSCs诱导分化为神经细胞，对于这一现象的有待进一步探讨。