HMG-CoA还原酶抑制剂对INS-1细胞Ras/Raf/ERK/CREB信号转导通路的影响

摘要

目的:胰岛素抵抗和胰岛β细胞胰岛素分泌功能受损是2型糖尿病发病的两个最重要的病理生理机制。如何最大限度地保护胰岛β细胞功能，避免糖尿病患者因使用其它药物而导致本已受损的β细胞功能进一步恶化，一直是医学界关注的焦点。目前已经证实，多种临床药物均可影响胰岛β细胞功能，影响胰岛素分泌，进而影响糖代谢。
　　阿托伐他汀作为HMG-CoA还原酶抑制剂，以其明确的调脂疗效和较好的耐受性而广泛应用于糖尿病患者，且时间窗越来越早、应用时间越来越长、剂量越来越大。该类药物的调脂外作用也日益受到关注，其中包括对糖尿病的影响。近来多项临床荟萃分析发现他汀类药物使糖尿病的患病风险增加，且呈药物剂量依赖性，但具体机制尚不清楚。体内外研究证实，HMG-CoA还原酶抑制剂除具有良好的降低胆固醇水平作用外，还可通过抑制胰岛β细胞ATP敏感K+通道和电压依从性钙通道活性而抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，通过抑制胰岛素启动子活性而抑制胰岛素mRNA表达。但HMG-CoA还原酶抑制剂通过何种具体机制抑制胰岛素启动子活性进而抑制胰岛素合成目前尚未见相关研究报道。
　　HMG-CoA还原酶抑制剂通过抑制甲羟戊酸代谢产物如焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸龙牛儿基龙牛儿醇(GGPP)的合成，使依赖FPP、GGPP修饰的小GTP蛋白如Ras和Rho不能定位于细胞膜，从而抑制细胞内信号传导。Ras/Raf/ERK/CREB信号通路是目前比较明确的胰岛素信号通路，主要参与胰岛素的基因转录调控。由此，HMG-CoA还原酶抑制剂与Ras/Raf/ERK/CREB信号通路的关系值得深入探讨。本研究观察高糖刺激下阿托伐他汀干预后胰岛β细胞株INS-1细胞Ras/Raf/ERK/CREB信号通路中各个关键激酶活性的变化以及细胞核转录因子CREB/DNA结合活性，以明确阿托伐他汀对Ras信号转导通路分子水平变化的影响，探讨他汀类药物抑制胰岛β细胞胰岛素启动子活性，进而抑制胰岛素mRNA表达的作用机制。
　　方法:以胰岛β细胞株INS-1细胞为模型，体外观察阿托伐他汀对INS-1细胞Ras复合体途径中(Ras/Raf/ERK/CREB)的影响。本实验分别采用Westernblot、RT-PCR方法检测阿托伐他汀对胰岛素信号转导通路中的Ras复合体途径中各关键酶(RasGTPase、p-Raf-1、p-CERB)活性变化。采用染色质免疫共沉淀法检测阿托伐他汀对INS-1细胞p-CREB/DNA结合活性的影响。
　　结果:
　　(1)高糖(25mmol/L)诱导INS-1细胞Ras通路蛋白活性增加，且呈时间依赖性。实验结果显示高糖组磷酸化Raf-1激酶表达水平与正常组比较明显增高，随着时间的延长，磷酸化水平逐渐增加，2小时表达开始增高，6小时增高明显，达对照组的2.4倍，而对Raf-1的蛋白总量影响不大。
　　(2)阿托伐他汀呈浓度依赖性抑制INS-1细胞Ras通路中关键因子蛋白p-Raf-1的活性。不同浓度阿托伐他汀处理细胞24h后，随着阿托伐他汀浓度增加，磷酸化Raf-1表现为明显抑制，表达量逐渐减少。与对照组相比，p-Raf-1表达水平在1μmol/L及10μmol/L时下降不明显(P>0.05)，在50μmol/L时出现明显降低(P<0.01)，在100μmol/L时阿托伐他汀组中出现较强的抑制(P<0.01)。
　　(3)50μmol/L阿托伐他汀抑制INS-1细胞Ras通路中关键因子蛋白的活性。INS-1细胞经高糖(25mmol/L)刺激6小时后加用50μmol/L阿托伐他汀处理，经Westernbloting检测显示，与高糖组相比，阿托伐他汀组RasGTPase、p-Raf-1、p-CREB的蛋白表达水平均明显下降，抑制率分别为61.8％、60.9％、55.4％(P<0.01)。
　　(4)本实验在基因水平检测发现各关键酶表达没有变化，高糖组RasmRNA表达与对照组相比变化不明显，与同浓度葡萄糖组相比，阿托伐他汀组、RasGTPase抑制剂ManumycinA组RasmRNA表达无明显变化(P>0.05)。
　　(5)阿托伐他汀抑制INS-1细胞p-CREB/DNA结合活性。与对照组相比，高糖刺激后INS-1细胞p-CREB/DNA结合量明显增高。与高糖组相比，阿托伐他汀药物处理组及ManumycinA组p-CREB/DNA结合量均明显下降(P<0.01)。
　　结论:
　　(1)体外高糖能明显诱导胰岛β细胞株INS-1细胞Ras/Raf/ERK/CREB信号通路中关键酶活性增加，且呈时间依赖性。
　　(2)阿托伐他汀浓度依赖性抑制胰岛β细胞株Ras/Raf/ERK/CREB信号转导通路RasGTPase的活性，抑制通路的激活。进一步抑制其下游分子p-Raf-1、p-CERB蛋白表达，降低INS-1细胞p-CREB与DNA的结合量。
　　(3)阿托伐他汀通过抑制胰岛β细胞中Ras蛋白的翻译后修饰，抑制RasGTPase活性，进而抑制胰岛素信号转导通路中的Ras复合体途径(Ras/Raf/ERK/CREB)中各关键酶活性，导致p-CREB/DNA结合量降低而抑制胰岛素启动子活性，抑制胰岛素合成。提示他汀类药物对糖尿病胰岛功能的影响部分与其对Ras/Raf/ERK/CREB信号通路的抑制有关。